(一)原理

    顯示染色體主要是顯示分裂中期細(xì)胞。因細(xì)胞分裂處于中期時(shí)，染色體的長短和大小恰到好處，是研究染色體的階段。所以，*需要獲得多量的中期分裂象；第二·人類染色體有46條，密集在細(xì)胞中，相互交錯(cuò)纏繞，必須把它們分散開，才便于觀察。

(二)提高染色體顯示的措施

1．提高細(xì)胞分裂象數(shù)

(1)刺激細(xì)胞增殖：大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞群在指數(shù)增生期時(shí)，細(xì)胞分裂指數(shù)在1％～5％；其中二倍體細(xì)胞和初代培養(yǎng)細(xì)胞較低，平均1％～2％，傳代細(xì)胞系，尤以永生性轉(zhuǎn)化細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞系等較高，可達(dá)3％～5％。另一些如初代淋巴細(xì)胞培養(yǎng)則很少出現(xiàn)分裂，為此常采用刺激細(xì)胞增殖措施。刺激淋巴細(xì)胞增殖主要用PHA，白菜豆(phaseolus vulgaris)中提取，有商品出售，PHA分P和M兩型，M型作用較強(qiáng)。PHA特別適用于外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，有強(qiáng)烈的刺激T淋巴細(xì)胞增殖的作用，用量每10 ml培養(yǎng)液加PHAO．2ml．

(2)阻抑中期分裂

1)秋水仙素法：處于指數(shù)增生期的培養(yǎng)細(xì)胞分裂雖然活躍、分裂象數(shù)量較多，但做分析用尚顯不足。主要原因是，分裂象雖多，但并不同步，都處于分裂各不同期，其中處于分裂中期的細(xì)胞數(shù)并不很多。應(yīng)用秋水仙素作用能顯著提高中期分裂象數(shù)(或用其衍生物秋水仙胺，秋水仙胺作用比前者強(qiáng)10倍)。秋水仙素有特異抑制紡錘絲蛋白合成作用，能阻抑分裂中期活動(dòng)，而對(duì)DNA作用較小，借此可截獲很多中期分裂象，產(chǎn)生類似提高分裂指數(shù)的效應(yīng)。該藥有強(qiáng)烈的毒性，用量過大或作用時(shí)間過長，可使染色體縮短和發(fā)生異常分裂現(xiàn)象。一般用量：秋水仙素O．02～0．8μg／ml營養(yǎng)液；秋水仙胺0．(902～O．08μg／ml營養(yǎng)液，作用時(shí)間2～6h。

2)低溫處理：把指數(shù)生長期細(xì)胞放置到室溫或冰箱中4℃4～12h，因溫度降低時(shí)DNA合成受抑制，細(xì)胞不進(jìn)入分裂期，當(dāng)恢復(fù)用37℃溫箱培養(yǎng)并用秋水仙素后，會(huì)出現(xiàn)代償性分裂高潮，也產(chǎn)生提高分裂象數(shù)效應(yīng)。

2．促染色體分散措施

(1)低滲處理：應(yīng)用低滲鹽溶液處理，可使細(xì)胞體積脹大、染色體松散，便于制備染色體標(biāo)本。低滲可用蒸餾水、1％*、加水稀釋培養(yǎng)液(1：3)、O．075M KCl等方法。目前zui多用的是0．075M KCl，在37℃水浴中作用20～40min，效果。

(2)醋酸固定：大多數(shù)固定劑都使組織細(xì)胞收縮，而醋酸卻有膨脹固定作用，和醇類混合固定有利于染色體松散效應(yīng)?，F(xiàn)多應(yīng)用醋酸／甲醇(1：3)混合液固定，用時(shí)宜現(xiàn)用現(xiàn)配。

(三)材料方法

1．材料

(1)細(xì)胞

(2)試劑

Hanks液

2％NaHCO3

1640合成培養(yǎng)基，含小牛血清lO％～15％

秋水仙素溶液

(3)器具：酒精燈、培養(yǎng)瓶、吸管、刻度離心管。

2．方法

(1)培養(yǎng)細(xì)胞：取處于指數(shù)生長期，用較大平皿培養(yǎng)的，80％～90％匯合單層培養(yǎng)細(xì)胞。

(2)加秋水仙素：使用zui終濃度為O．02～O．8gg／ml營養(yǎng)液；溫箱繼續(xù)培養(yǎng)6～10h；麥用低溫封閉法：把培養(yǎng)細(xì)胞置于4℃條件下6～12h后，再于37℃溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)6～10h處理(加秋水仙素)。

(3)采集分裂細(xì)胞：可利用分裂中期細(xì)胞體變圓與底物附著不牢特點(diǎn)，此時(shí)手持培養(yǎng)瓶，左右反復(fù)橫向水平搖動(dòng)，令培養(yǎng)液在培養(yǎng)細(xì)胞表面反復(fù)沖洗，應(yīng)用此法可使90％的中期分裂細(xì)胞從瓶壁脫落；注意勿用力過猛，以防多量非分裂細(xì)胞脫落影響觀察。

(4)離心：收集培養(yǎng)液，1000r／min離心5～lOmin。

(5)低滲處理：吸除上清液、加入預(yù)溫至37℃的0．075 mol／L KCl溶液，在溫箱中靜置
20～30min．

(6)預(yù)固定：向懸液中加新鮮1：3醋酸、甲醇固定液lml，用吸管吹打均勻；此措施能起到先使細(xì)胞表面輕微固定，可防止固定后細(xì)胞粘連成塊。

(7)固定；離心，同(4)，吸除上清液，加新鮮固定劑5~10ml；加固定劑時(shí)要用一手微斜持離心管，另手用吸管吸取固定劑，把固定劑逐滴滴在離心管壁上·使之慢慢流人離心管中，然后輕輕吹打均勻，置15~20min。

(8)重復(fù)(7)，末次離心后，小心吸除大部上清液，據(jù)懸液中細(xì)胞密度大小，余下固定液0．5～1ml。

(9)制片：用滴片法制片，按如下步驟：*洗凈載物片，勿留任何油脂，置冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。滴片前先從冰箱中取出冷載物片1張，在載物片表面出現(xiàn)細(xì)微水氣時(shí)，立即向片的一側(cè)滴2～3滴細(xì)胞懸液(如固定液不散，可能因載物片未洗凈或不冷所致)·滴片時(shí)的距離能保持半米高度才好。滴片后置室溫中令其自然干燥，或用吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)吹干亦可。如此制備好的標(biāo)本可置盒中備用(做顯帶或熒光觀察等)或立即進(jìn)行染色觀察。

(10)染色和封片：一般常用Giemsa染色；取干液Giemsa 1份加pH6．8磷酸緩沖液9份混合，染色10min后，水洗、晾干、可直接觀察(使用油浸鏡)；如標(biāo)本需要保存或做長時(shí)間觀察，可過二甲苯兩次后，用中性樹膠封片(或先迅速過丙酮兩次，每次30s)后，再過二甲苯，然后封片亦可。