質(zhì)粒載體的改造

⑴去掉不必要的DNA區(qū)段。細(xì)胞

⑵減少限制酶的識(shí)別位點(diǎn)，一種酶只保留一個(gè)。（單一的限制性酶切位點(diǎn)）。

⑶加入易于撿出的選擇性標(biāo)記基因。

⑷對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行安全性改造，要求質(zhì)粒不能隨便 轉(zhuǎn)移。

⑸改造或增加基因表達(dá)的調(diào)控序列。

1、質(zhì)粒pBR322

結(jié)構(gòu)：

（1）氨芐*抗性基因（ampr或Apr）

內(nèi)部有3種限制酶單一識(shí)別位點(diǎn) 。

（2）四環(huán)素抗性基因（tetr或Tcr）

內(nèi)部有7種，啟動(dòng)區(qū)內(nèi)有2種限制酶單一識(shí)別位點(diǎn) 。

（3）DNA復(fù)制起點(diǎn)（ori）

pBR322質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)：

（1）具有較小的分子量。

4363bp，2.6×106Da，

（2）具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)。

（3）具較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過(guò)*擴(kuò)增之后,每個(gè)細(xì)胞中可累積1000～3000個(gè)拷貝。

（4）對(duì)多種常見(jiàn)的限制性?xún)?nèi)切核酸酶只含有一個(gè)能切割的位點(diǎn)。

2、pUC質(zhì)粒載體

1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技術(shù)在pBR322基礎(chǔ)上構(gòu)建的。

結(jié)構(gòu)：

（1）來(lái)自于pBR322的Ori

（2）氨芐*的抗性基因(ampr)。 但核苷酸序列發(fā)生了變化

（3） LacZ′基因

編碼β—半乳糖酶的α—肽鏈即氨基末端。

（4）MCS區(qū)段

是一段用于插入外源DNA片段的特定區(qū)域，由一系列的緊密相連的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)組成，而且每個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)在整個(gè)載體中是*的。

與pBR322相比， pUC質(zhì)粒載體優(yōu)點(diǎn)：

（1）具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)

如pUC8為2 750bp，pUCl8為2 686bp，控制質(zhì)粒復(fù)制rop基因的缺失，平均每個(gè)細(xì)胞即可達(dá)500～700個(gè)拷貝

（2）適用于組織化學(xué)法檢測(cè)重組體

通過(guò)a-互補(bǔ)作用，利用菌落顏色篩選重組子。

（3）具有多克隆位點(diǎn)區(qū)段（MCS）

可以定向克隆防止載體自我連接。