葡萄糖在小鼠克隆胚胎發(fā)育中的作用

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 克隆胚胎制備和胚胎培養(yǎng)

卵母細(xì)胞在含有5.5mM葡萄糖的CZB培養(yǎng)液中培養(yǎng)。用含有5.5mM葡萄糖和2.5ug/ml 細(xì)胞松弛素B的HEPES-CZB液(HCZB)作為工作液，卵母細(xì)胞在此液中被去掉紡錘體-染色體復(fù)合體；用卵丘細(xì)胞作為核供體。用注射針反復(fù)吸入、吹出卵丘細(xì)胞，以除去其細(xì)胞膜和大部分細(xì)胞質(zhì)，然后用注射針將裸卵的核注入去除紡錘體-染色體復(fù)合體的卵母細(xì)胞中。

孤雌胚胎所用的卵母細(xì)胞與用于制備核移植胚胎的卵母細(xì)胞來源相同。

孤雌胚胎和核移植胚胎用不含Ca2 、卻含10mM Sr2 和細(xì)胞松弛素B的CZB培養(yǎng)液進(jìn)行激活。所有步驟中都不使用二甲基亞砜，以避免其對克隆胚胎造成的不受控制的影響。單細(xì)胞正常受精胚胎是通過超排的(B6D2)F1雌鼠和(B6D2)F1雄鼠交配獲得的。

所有胚胎用Whitten 培養(yǎng)液(MW)培養(yǎng)。之所以選擇此培養(yǎng)液是因?yàn)槔?B6D2)F1小鼠卵母細(xì)胞制備的受精胚胎、孤雌胚胎和核移植胚胎在此種培養(yǎng)液中更利于它們除了二細(xì)胞期之外的胚胎發(fā)育。對正常胚胎發(fā)育有更好的促進(jìn)作用的其他培養(yǎng)液，對克隆胚胎卻有阻滯作用，所以不被采用。

2. 分析葡萄糖代謝

胚胎在WM中過夜培養(yǎng)，到單細(xì)胞后期或二細(xì)胞中期時(shí)用來進(jìn)行葡萄糖代謝分析。我們利用[1-14C]葡萄糖、[6-14C]葡萄糖、[5-3H]葡萄糖，來分析葡萄糖代謝情況。使用[1-14C]葡萄糖時(shí)，14 CO2 經(jīng)過戊糖磷酸途徑或三羧酸循環(huán)釋放。使用[6-14C]葡萄糖時(shí)，14 CO2僅通過三羧酸循環(huán)釋放。使用[5-3H]葡萄糖時(shí)，3 H2O 僅通過糖酵解途徑釋放。14CO2和3H2O用一種裝置收集然后通過一種方法進(jìn)行量化。通過比較三種不同位置同位素標(biāo)記的葡萄糖的代謝率，可以確定不同途徑的代謝率。為了準(zhǔn)備用于測量代謝的培養(yǎng)液，我們在真空條件下冷凍適量的[1-14C]葡萄糖、[6-14C]葡萄糖、[5-3H]葡萄糖，然后用不含葡萄糖的HCZB進(jìn)行溶解。用冷的非放射性葡萄糖將溶液中葡萄糖的含量增加至4mM。

根據(jù)放射性物質(zhì)的放射性強(qiáng)弱，將5-20枚胚胎放到1ml注射器的空心活塞中。注射針管中放有600ul 0.1M 的NaOH，用來捕獲胚胎釋放出的14 CO2 和3 H2O 。將裝有胚胎的活塞推入注射器，蓋上針帽。此簡易裝置與Eppendorf懸滴系統(tǒng)相比，兩者在敏感度和檢測準(zhǔn)確度上并沒有差異，但是我們發(fā)現(xiàn)前者在將檢測物質(zhì)放入注射器時(shí)，不會(huì)發(fā)生很大的傾斜，并且放入物質(zhì)能夠很快的有效聚集在一起。經(jīng)過37°C、3h的孵育后，小心的將NaOH捕獲液轉(zhuǎn)移到發(fā)光瓶中，1h后，確定代謝物種輻射量的多少。每次試驗(yàn)，都要有四個(gè)空白對照(不放胚胎)，但含有5ul HCZB，在同樣的條件下進(jìn)行孵育，用以說明葡萄糖降解的原因，也用于進(jìn)行下一步的計(jì)算。

計(jì)算出葡萄糖降解的效率，并用每枚胚胎每小時(shí)降解多少皮摩爾表示出來。每次試驗(yàn)至少重復(fù)三次，每次試驗(yàn)所用胚胎數(shù)為3-6枚。

3. 酶和代謝分析

用冷凍干燥法處理胚胎，然后用來進(jìn)行酶和代謝分析。每枚胚胎在油下進(jìn)行萃取，并用來進(jìn)行酶循環(huán)分析。計(jì)算每個(gè)胚胎中各自的ATP含量。相似的，計(jì)算每個(gè)胚胎內(nèi)部的糖原水平。腺苷酸酶和糖原合酶的分析在前邊已經(jīng)介紹了。所有代謝的計(jì)算，都用每千克濕重含有多少mmole物質(zhì)表示(每枚胚胎重160ng或160pl)。每次試驗(yàn)至少重復(fù)三次，每種胚胎zui后分析數(shù)量必須達(dá)到10-20枚。

4. 線粒體拷貝數(shù)量

利用熒光定量PCR，檢測線粒體DNA(mtDNA)與核DNA(nDNA)的比率，從而間接測定mtDNA的含量。所用的mtDNA引物：5-CAGGATGAGCCTCAAACTCC-3(上引物)和5-GGTCAGGCTGGCAGAAGTAA-3(下引物) 。所用的nDNA引物(18S核糖體RNA)：5-TCGAGGCCCTGTAATTGGAA-3(上引物)和5-CCCTCCAATGGATCCTCGTT-3(下引物)。每枚單個(gè)胚胎放入0.2ml PCR管中，其中含有1ul 17uM SDS和 2ul 125ug/ml 蛋白酶K，37°C孵育過夜，然后95°C 15min 用以使蛋白酶失活。

5. 線粒體的超微結(jié)構(gòu)

從每個(gè)處理組取五枚胚胎，用2%多聚甲醛和0.6%戊二醛的混合物固定，然后用含有1%的二甲基胂酸鈉進(jìn)行后固定，再用一系列濃度逐步升高的乙醇對其進(jìn)行脫水處理，然后用PolyBed 812 樹脂包埋。用切片機(jī)制備超薄切片，將切片放到銅網(wǎng)上，用醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染色，然后放到Ieol 1200 EX 顯微鏡下進(jìn)行觀察。至少每個(gè)處理組的三枚胚胎用來進(jìn)行主觀上的線粒體形態(tài)學(xué)上的評定，并用好、中、差來表示。

6. MitoTracker 染色和分析

為了能夠看到有活性的線粒體，胚胎在含有葡萄糖的WM液(WM-)中或不含葡萄糖的WM液(WM )中孵育30min，上述兩液均含有500nM 氯甲基-四甲基-rosamine(MitoTracker，分子探針)。MitoTracker是對活性線粒體特異的熒光探針。樣本經(jīng)上述處理后，在培養(yǎng)液中洗60min，然后用4%多聚甲醛固定30min。此染色法是可見的，胚胎顯微鏡(Eclipse 800; Nikon Instruments,Melville, NY)拍照。上述顯微鏡配備有表面熒光和不同干涉相差光學(xué)系統(tǒng)。顯微鏡放大倍數(shù)為 X60，聚焦于每枚胚胎zui長的直徑上；用Cool Snap 相機(jī)和 MetaMorph 7.1.0.0 軟件系統(tǒng)取相。線粒體形態(tài)學(xué)分析用MetaMorph中的形態(tài)學(xué)分析工具進(jìn)行分析。手動(dòng)記錄每枚胚胎的周長(每個(gè)胚胎階段，每個(gè)處理組都要分析五枚胚胎)，記錄周長的相關(guān)像素強(qiáng)度值都會(huì)被軟件記錄，將這些值錄入Microsoft Excel以計(jì)算每個(gè)階段、每個(gè)處理組的平均值。