17羥孕酮Elisa試劑盒為了防止因污染或技術(shù)原因使培養(yǎng)功虧一簣,考慮到培養(yǎng)細(xì)胞因傳代而遲早會(huì)出現(xiàn)變異,有時(shí)因寄贈(zèng)、交換和購買,培養(yǎng)細(xì)胞從一個(gè)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)運(yùn)到另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室,的策略是進(jìn)行低溫保存。這對(duì)于維持一些特殊細(xì)胞株的遺傳特性極為重要?,F(xiàn)簡(jiǎn)要介紹深低溫保存法(-70℃~-196℃)的特點(diǎn)。細(xì)胞深低溫保存的基本原理是:在-70℃以下時(shí),細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止,即代謝處于*停止?fàn)顟B(tài),故可以保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵,在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內(nèi),水晶呈針狀,極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。
1. 細(xì)胞的凍存
為避免污染造成的損失,zui小化連續(xù)細(xì)胞系的遺傳改變和避免有限細(xì)胞系的老化和轉(zhuǎn)化,需要凍存哺乳細(xì)胞。凍存細(xì)胞前,細(xì)胞應(yīng)該特性化并檢查是否污染。
有幾種普通培養(yǎng)基用來凍存細(xì)胞。對(duì)于包含有血清的培養(yǎng)基,成分可能如下:
◆包含10%甘油的*培養(yǎng)基,
◆包含10%二甲基亞砜(DMSO)的*培養(yǎng)基,
◆50%細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50%含有10%甘油的新鮮培養(yǎng)基,
◆50%細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50%含有10%二甲基亞砜的新鮮培養(yǎng)基。
對(duì)于無血清培養(yǎng)基,一些普通的培養(yǎng)基成分可能是:
◆50%細(xì)胞條件無血清培養(yǎng)基和50%包含有7.5%二甲基亞砜的新鮮的無血清培養(yǎng)基,或
◆包含有7.5%二甲基亞砜和10%細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)BSA的新鮮無血清培養(yǎng)基。
(1)懸浮細(xì)胞
●計(jì)數(shù)將要凍存的活細(xì)胞。細(xì)胞應(yīng)該處于對(duì)數(shù)生。以大約200~400 g離心5分鐘沉淀細(xì)胞,使用移液管移去上清到zui小體積,不要攪亂細(xì)胞。
●以1×107到5×107細(xì)胞/ml密度,在包含有血清的冷凍培養(yǎng)基中再次懸浮細(xì)胞,或者以0.5×107到1×107在無血清培養(yǎng)基中,再次懸浮細(xì)胞。
●分裝進(jìn)凍存管,將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中,5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。
●細(xì)胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍,可以通過可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中,然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。
(2)貼壁細(xì)胞
●使用分離試劑從基層分離細(xì)胞,分離時(shí)盡可能溫和,使對(duì)細(xì)胞的損傷減少到zui小。
●在*生長培養(yǎng)基中,再次懸浮分離細(xì)胞,確定有活力細(xì)胞數(shù)。
●以大約200 g離心5分鐘沉淀細(xì)胞。使用移液管移去上清到zui小體積,不要攪亂細(xì)胞。
●以5×106到1×106細(xì)胞/ml密度,在凍存液中懸浮細(xì)胞。
●分裝進(jìn)凍存管,將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中,5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。
●細(xì)胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍,可以通過可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中,然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。
2. 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇
凍存細(xì)胞較脆弱,要輕柔操作。凍存細(xì)胞要快速融化,17羥孕酮Elisa試劑盒并直接加入*生長培養(yǎng)基中。若細(xì)胞對(duì)凍存劑(DMSO或甘油)敏感,離心去除凍存培養(yǎng)基,然后加入*生長培養(yǎng)基中。
(1)直接鋪板方法
●取出貯存細(xì)胞,37℃水浴中快速融化。
●直接用*生長培養(yǎng)基鋪板細(xì)胞。1 ml凍存細(xì)胞使用10~20 ml*生長培養(yǎng)基。進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù),細(xì)胞接種應(yīng)該至少在3×105活細(xì)胞/ml。
●培養(yǎng)細(xì)胞12到24小時(shí),更換新鮮的*生長培養(yǎng)基,去除凍存劑。
(2)離心方法
●取出貯存細(xì)胞,37℃水浴中快速融化。
●把1到2 ml凍存細(xì)胞加入到大約25 ml*生長培養(yǎng)基,輕輕混勻。
●以大約80x g離心2到3分鐘。
●棄去上清。
●在*生長培養(yǎng)基輕輕再次懸浮細(xì)胞,并且進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。
●17羥孕酮Elisa試劑盒細(xì)胞鋪板,細(xì)胞接種應(yīng)該至少為3×105活細(xì)胞/ml。