產(chǎn)品僅供研究使用，不適用于人類或臨床診斷
商品屬性：

產(chǎn)品英文名稱：Mouse RANKL protein

產(chǎn)品中文名稱：重組小鼠NF-κB受體激活因子配體RANKL

規(guī)格：2 μg/10 μg/100 μg/1 mg

貨號(hào)：EY-01X8640
用途：僅供科研研究實(shí)驗(yàn)

特點(diǎn)&優(yōu)勢(shì):

標(biāo)簽:無(wú)標(biāo)簽

表達(dá)宿主:大腸桿菌

種屬:小鼠

序列:氨基酸序列來源于： 小鼠RANKL (O35235)(Pro143-Asp316) 表達(dá)的蛋白片段。

活性:檢測(cè)其與配體的結(jié)合能力，檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)類型為功能性ELISA。包被的 1 μg/mL(100μl/孔)小鼠sRANKL可以結(jié)合人OPG(C-Fc)，人OPG的EC50值為55 ng/mL。 OPG為55 ng/mL

蛋白長(zhǎng)度：重組小鼠sRANKL由174個(gè)氨基酸（N-Met）組成，預(yù)測(cè)分子量為19 kDa。 在還原條件下，在SDS-PAGE中，小鼠sR動(dòng)?動(dòng)

背景

RANKL是腫瘤壞死因子配體超家族成員11，也稱為核因子kappa-B受體激活因子的配體，骨保護(hù)素配體，TNFSF11，RANKL，TRANCE，OPGL和CD254, 在多種細(xì)胞中表達(dá)，如成骨細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，活化的T淋巴細(xì)胞，以及骨髓間質(zhì)細(xì)胞。RANKL可以與誘騙受體OPG反應(yīng)，并參與許多基礎(chǔ)生物學(xué)過程，例如充當(dāng)T細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞之間相互作用的調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)T- 細(xì)胞依賴的免疫效應(yīng)，并可以增強(qiáng)高鈣血癥的骨吸收。重要的是，RANKL可以增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞刺激初始T細(xì)胞的增殖能力。

本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn):

 1.操作簡(jiǎn)便、快捷?？芍苯蛹尤氲綑z測(cè)平板。在96-孔板中檢測(cè)時(shí),無(wú)需洗滌或收獲細(xì)胞,免去溶解步驟。

2. 無(wú)放射性。不需要配制液閃混合物,也不需要處理廢棄物。

3. 與MTT相比,使用更安全。不需要使用揮發(fā)性的有機(jī)溶劑來溶解甲臜產(chǎn)物。

4. 操作靈活,與MTT不同,平板讀數(shù)后可放回溫箱繼續(xù)孵育,使顏色進(jìn)一步生成。

操作步驟：

(一)獲得目的基因

1、通過PCR方法:以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板,按基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)),PCR循環(huán)獲得所需基因片段。

2、通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。

(二)構(gòu)建重組表達(dá)載體

1、載體酶切:將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(同引物的酶切位點(diǎn))進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

(三)  獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種

1、 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,根據(jù)重組載體的標(biāo)志(抗Amp或藍(lán)白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質(zhì)粒,雙酶切初步鑒定。

2、 測(cè)序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆,重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。

3、 以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。

(四)誘導(dǎo)表達(dá)

1、挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養(yǎng)。

2、按1∶50比例稀釋過夜菌,一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中, 37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大約需3hr)。

3、取部分液體作為未誘導(dǎo)的對(duì)照組,余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM作為實(shí)驗(yàn)組,兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。

4、分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收獲沉淀,用100μl 1%SDS重懸,混勻, 70℃10min。

5、離心12000g×1min,取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。

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