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上海瑞齊生物科技有限公司

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*試劑盒說明書

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*酶聯(lián)免疫反應(yīng)測試盒使用說明書
.簡介

1.試劑盒描述
    *作為一種*類物質(zhì),能抑制細(xì)菌DNA螺旋酶活性。它作為*類代表類藥物,用于由沙門氏菌、巴氏桿菌、支原體和嗜血桿菌類引起的動物傳染病。*和他的主要代謝產(chǎn)物*在肌肉組織、脂肪和牛奶中zui大殘留*100ppb。MaxSignalTM*酶聯(lián)免疫反應(yīng)測試盒為養(yǎng)殖者和政府監(jiān)督管理部門提供了低檢出限0.5 ppb的快速檢測技術(shù)。該試劑盒有以下特點(diǎn):
Ø         快速10-30分鐘之內(nèi)可完成從飼料、肌肉,牛奶、組織,血清和尿液中提取*的全過程且回收率達(dá)到75-95%。
Ø         快速的檢測(在不考慮樣品數(shù)量的情況下只需不到2小時)。
Ø         高重現(xiàn)性。
2.試劑盒原理
MaxSignalTM*酶聯(lián)免疫反應(yīng)測試盒基于競爭性酶聯(lián)反應(yīng)原理,含有*的抗原已經(jīng)包被于微孔板上。藥物分析時,樣品同特異性一抗共同被添加到板孔中。如果樣品中含有藥物,會競爭一抗,抑制抗體與板上包被的藥物抗原結(jié)合。加入酶標(biāo)記的二抗,形成包被抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物。加入底物后,產(chǎn)物的顏色強(qiáng)弱與樣品中藥物的濃度成反比。
3.試劑盒組成部分和儲存
1)試劑盒包括:
已包被抗原的酶標(biāo)板(Enrofloxacin-coated Plate)(可拆式).... 12×8
標(biāo)準(zhǔn)液(Standards)0,0.1,0.25,0.51.0,5.0 .............. 6×0.8mL
回收用10ppb(Spiking)(可選)................................................. 1×0.8ml
*一抗(Antibody #1)........................................................ 1×15mL
100×HRP酶標(biāo)二抗(HRP-Conjugated Antibody #2)................. 1×250µL
酶標(biāo)二抗稀釋液*(Antibody #2 Diluent)..................................... 1×20mL
20×濃縮洗液*(Wash Solution).................................................... 1×28mL
終止液*(Stop Buffer).................................................................... 1×20mL
底物*(TMB Substrate).................................................................. 1×12mL
10×樣品提取液(Sample Extraction Buffer)................................. 1×25mL
*可以和其他BIOO產(chǎn)品的交叉使用(有效期內(nèi))
2)試劑盒的保存
本試劑盒應(yīng)當(dāng)在2-8的溫度下儲存,有效期為一年。如果超過3個月不使用試劑盒,請將一抗和二抗放置-20冷凍保存。
3)樣品檢測下限

檢測物質(zhì)
檢測下限(ng/g
飼料
1.0
肌肉/肝臟/腎臟/魚類/
1.0
牛奶
0.5
血清
0.5
尿液
0.5
蜂蜜
2.0

 
4)交叉反應(yīng)數(shù)據(jù)
藥物
交叉反應(yīng)%
*(Enrofloxacin)
100
*(Ciprofloxacin)
100
達(dá)氟沙星(Danofloxacin)
52
*(Norfloxacin)
10
*(Enoxacin)
9
*(Pipemidic acid)
9
*(Ofloxacin)
8
培諾沙星(Benofloxacin)
7
氟甲喹(Flumequin)
6
惡喹酸(Oxolin acid)
5
*(Nalidixic acid)
3
4.其他需要而本試劑盒未提的設(shè)備或材料
ü          酶標(biāo)儀
ü          恒溫培養(yǎng)箱
ü          移液器(10、20100mL,1mL各一支
ü          漩渦振蕩器
ü          勻質(zhì)器
ü          多道移液器(50-300mL
 
.警告
實(shí)驗(yàn)前請閱讀以下文字,以保證獲得*實(shí)驗(yàn)效果。
ü          標(biāo)準(zhǔn)品中含有*,請小心使用。
ü          不要使用過期的試劑盒。
ü          不同批次的試劑盒不要混用,抗體和微孔板具有盒與批次的特異性。確保二抗及二抗稀釋液正確配制。
ü          盡量保持室溫20-25,避免在通風(fēng)口操作防止溫度過低,過熱和/或者蒸發(fā)。同樣的,不要在陽光直射下實(shí)驗(yàn),防止過熱及蒸發(fā)。在孵育期間,如果工作臺溫度過低,應(yīng)該鋪墊若干紙巾或者其他物料。
ü          水質(zhì)量很重要,確保使用蒸餾或者去離子水。
ü          加入樣品或者試劑到空的微孔板時,吸嘴靠于微孔接近底部,并保持接觸。
ü          孵育時間的計算越規(guī)范越好,保持添加標(biāo)準(zhǔn)品的一致性,先添加標(biāo)準(zhǔn)品后添加樣品。
ü          從低濃度到高濃度地添加標(biāo)準(zhǔn)品,降低影響標(biāo)準(zhǔn)品曲線質(zhì)量的風(fēng)險。
ü          將微孔板置于放有干燥劑的密封袋中,冷藏保存。
 
. MaxSignalTM  Enrofloxacin ELISA Test Kit檢測方法
1.試劑的準(zhǔn)備
所有的試劑在使用之前應(yīng)將其回溫至室溫,并在使用試劑前搖動幾下,以保證合理的濃度。
1二抗工作液
199的比例來配制酶標(biāo)二抗和二抗稀釋液,配成二抗的工作液。
2工作洗液
119的比例配制濃縮洗液和雙蒸餾水。
3樣品提取液
19的比例配制樣品提取濃縮液和雙蒸餾水。
435%乙醇/樣品提取液(用于檢測尿樣、血清、牛奶)
    混合6.5體積的樣品提取液和3.5體積100%乙醇。
2.樣品的準(zhǔn)備
2.1 飼料
1         1份樣品中加入570%的甲醇(如1g樣品+5mL70%甲醇),勻漿;
2         1.5ml勻漿樣品,室溫下(20-254000g離心5分鐘;
3         移取0.5mL上清液,加入0.5mL1×樣品提取液,混合均勻;
4         每孔加入50µL進(jìn)行檢測。
   稀釋倍數(shù):10.0
2.2 肌肉/肝臟/腎臟/魚類/
1         去除樣品中的脂肪,取合適的勻漿器對樣品進(jìn)行勻漿;
2         1g勻質(zhì)樣品,加入4mL70%甲醇;
3         zui大轉(zhuǎn)速下劇烈震蕩渦旋10分鐘;
4         室溫下4000g離心5分鐘;
5         移取0.5mL上清液,加入0.5mL樣品提取液,混合均勻,每孔取50µL樣品用于檢測。
稀釋倍數(shù):10.0
2.3 牛奶
1         對于無脂牛奶,取200µL牛奶+800µL35%乙醇/樣品提取液,混勻,每孔取50µL稀釋樣品進(jìn)行檢測;
2         對于含脂牛奶,取1ml樣品,4000g離心5分鐘以去除上層脂肪層,取出200µL牛奶+800µL35%乙醇/樣品提取液,混勻,每孔取50µL稀釋樣品進(jìn)行檢測。
稀釋倍數(shù):5.0
2.4血清
1   0.5ml樣品,4000g離心5min
2   取出0.2ml上清液,加入0.8ml35%甲醇/樣品提取液混合液,每孔取出50µL檢測。
    稀釋倍數(shù):5.0,根據(jù)實(shí)際需要樣品可用35%甲醇/樣品提取液混合液進(jìn)一步稀釋。
2.5 尿樣
1         0.5mL樣品,4000g離心5分鐘;
2         0.2mL上清液,加入0.8mL35%乙醇/樣品提取液,每孔取50µL檢測。
稀釋倍數(shù):5.0
2.6 蜂蜜
1   稱取0.1g蜂蜜樣品,加入1.9ml35%乙醇/樣品提取液混勻
2   每孔取50ul用于檢測
稀釋倍數(shù):20.0
 
3.酶聯(lián)免疫反應(yīng)測試步驟
以下為計算份量的表格,用戶可根據(jù)自己的需要來確定需要配制多少試劑。
試劑
每個反應(yīng)需要的體積
24次反應(yīng)的體積
一抗
100 mL
2.4mL
二抗工作液
150 mL
3.6 mL
工作洗液
2 mL
48 mL
終止液
100 mL
2.4 mL
底物
100 mL
2.4 mL
 
1         加入50mL的標(biāo)準(zhǔn)液或樣品于所設(shè)定的孔中;
2         在每孔中加入100mL一抗,輕輕敲擊微孔板邊緣1分鐘;
3         室溫(20-25)孵育30分鐘;
4         洗板3次,每次應(yīng)該加入250mL 1×洗液,zui后一次使板盡量甩干并在吸水紙上吸干;
5         每孔加入150mL 1×二抗(避免陽光直射和工作臺溫度過低,孵育時適當(dāng)覆蓋微孔板);
6         室溫(20-25)孵育30分鐘;
7         洗板3次,每次應(yīng)該加入250mL,zui后一次使板盡量甩干并在吸水紙上吸干;
8         加入100mLTMB底物(底物本身是無色的,出現(xiàn)顏色變化不能使用。孵育時適當(dāng)覆蓋微孔板);
9         加入底物后立即計時,輕敲試劑盒使混勻;
10      在室溫下培養(yǎng)15分鐘,加入100mL的終止液終止反應(yīng),在450nm下讀OD讀數(shù)前用無絨布擦拭微孔底部水分和指模。
4.結(jié)果計算
1   分別計算標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控和樣品的平均吸光度值和相對吸光度值。
2   相對吸光度值 (%) = (標(biāo)準(zhǔn)或樣品吸光度值/零標(biāo)準(zhǔn)吸光度值) ´ 100
3   以相對吸光度值為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
4   從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取質(zhì)控和樣品的濃度值。
5   樣品檢測下限和定量下限計算方法如下:
樣品檢測下限 = (0.1ng/g) ´ (稀釋倍數(shù)
樣品定量下限 = (0.25ng/g) ´ (稀釋倍數(shù)
    備注:如結(jié)果呈陽性反應(yīng),應(yīng)該用其他檢驗(yàn)方法(如色譜/質(zhì)譜方法等)進(jìn)行確證。
以下曲線圖是*酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測試劑盒典型標(biāo)準(zhǔn)曲線
 
 
. 問題與解決
1.標(biāo)準(zhǔn)品無顏色變化或者無相應(yīng)數(shù)值

可能原因
解決方法
試劑使用順序混亂,或者操作步驟出錯。
遵循實(shí)驗(yàn)說明重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
使用了錯誤的抗體,或者二抗配制錯誤、失效。
確保抗體來自同一試劑盒,所有抗體不同批次之間有一定的差異,確保二抗的配制無誤。
TMB底物失效。
使用新的BIOO TMB底物。

 
2.低吸光度(OD值)

可能原因
解決方法
試劑過期,或者不同的批次混用。
查證過期試劑和批次。
洗液配制錯誤。
使用試劑盒提供的洗液,正確配制。
過多次洗滌。
按照說明書要求進(jìn)行洗滌。
孵育時間過短。
按照說明書要求,嚴(yán)格計算好時間。
實(shí)驗(yàn)室溫度過低。
保持實(shí)驗(yàn)室溫度在20-25,不要在空調(diào)風(fēng)口或者寒冷的窗戶旁進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
試劑或者微孔板溫度過低。
確保試劑或者微孔板*回溫,在實(shí)驗(yàn)開始前,將試劑放置盒子外zui少1小時。
使用錯誤波長讀數(shù),或者酶標(biāo)儀失靈。
確保450nm波長讀數(shù),檢查酶標(biāo)儀。
試劑盒處于的條件。
檢查試劑盒從冰箱拿出使用的次數(shù),檢查試劑盒是否放置溫度(過冷或者過熱)時間太長。

 
3.過高的背景值或吸光度(OD值)

可能原因
解決方法
使用了質(zhì)量差的水。
如果使用的水可疑,嘗試使用蒸餾水配制洗液。
底物失效。
確保加入微孔板前,底物是無色的。
洗滌不當(dāng)或者洗板機(jī)洗板效果不好。
采用說明書建議的洗滌次數(shù),每次每孔至少加入250μL洗液。檢查洗滌系統(tǒng),排除故障。
酶標(biāo)儀失靈。如果OD值讀數(shù)很高而顏色很淺,那個這是非??赡艿那闆r。
使用校正微孔板檢查酶標(biāo)儀,檢查光源。
實(shí)驗(yàn)室溫度過高。
保持實(shí)驗(yàn)室溫度20-25,避免在熱源或者陽光直射處實(shí)驗(yàn)。
試劑混淆,被污染或者配制不當(dāng)。
確保使用正確的試劑,準(zhǔn)確配制,避免污染。

4.板內(nèi)差異性大

可能原因
解決方法
加入標(biāo)準(zhǔn)品,試劑和樣品的時間不一致。
確保所有試劑可用,盡可能使用多道槍加樣,加標(biāo)準(zhǔn)品,試劑和樣品途中,不能中斷。
多道槍使用不當(dāng)。
校準(zhǔn)多道槍,檢查吸嘴是否套緊,確保吸液量一致。
洗滌系統(tǒng)出現(xiàn)故障。
檢查洗滌系統(tǒng),保持良好運(yùn)行。

5.板間差異性大

可能原因
解決方法
板與板之間孵育時間相差太大。
獨(dú)立計時,確保一致的孵育時間。
板與板之間不一致的洗滌過程。
確保相同的洗滌次數(shù),保證洗滌系統(tǒng)正常運(yùn)作。
使用移液槍不當(dāng)。
檢查移液槍,確保吸取相同液量。
微孔板,試劑,標(biāo)準(zhǔn)品和樣品處于不同溫度。
確保微孔板,試劑,標(biāo)準(zhǔn)品和樣品充分回到室溫,如果試劑體積較大則需要回溫較長時間。不能用溫水浴回溫樣品。
不同批次的試劑混用,或者試劑盒過期。
注意試劑不要混用,不同的試劑盒可能顯示不同的OD值,但是相對吸光值是有很好的對比性的。通常0標(biāo)準(zhǔn)品的OD值小于0.6顯示試劑質(zhì)量下降。

 
6.一個或者多個標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)點(diǎn)超出曲線范圍

可能原因
解決方法
標(biāo)準(zhǔn)品添加順序混亂,或者放置于錯誤位置。
按照說明要求重復(fù)實(shí)驗(yàn),保證標(biāo)準(zhǔn)品添加正確。
標(biāo)準(zhǔn)品被污染或者與其他標(biāo)準(zhǔn)品混淆了。
改用新的標(biāo)準(zhǔn)品,按照由低濃度到高濃度的順序添加標(biāo)準(zhǔn)品。
洗滌不一致或者洗滌系統(tǒng)失靈。
遵循一如既往的洗滌方式,檢查洗滌系統(tǒng)。
加入標(biāo)準(zhǔn)品和試劑的時間不一致。
確保一切就緒,由低濃度到高濃度添加標(biāo)準(zhǔn)品并保證不被打擾,使用多道槍移液。
多道槍使用不當(dāng)。
校準(zhǔn)多道槍,檢查吸嘴是否套緊,確保吸液量一致。

 

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