人丙酮酸脫氫酶β(PDHb)重組蛋白

1、組織蛋白提取

1）所需器材：制冰機(jī)、標(biāo)記筆、兩套1.5ml EP管（高溫高壓處理）、一個(gè)大冰盒、一個(gè)1.5ml EP管盒、手套、眼科剪（高溫高壓處理）、新鮮組織或保存于-80℃冰箱組織、保存于4℃冰箱的PBS（高溫高壓處理）、移液槍、吸頭（高溫高壓處理）、兩套研磨棒（高溫高壓處理）、掌上離心機(jī)、濾紙、三去污裂解液、苯甲基磺酸氟（PMSF，一種蛋白酶抑制劑，劇毒）、離心機(jī)、燒杯、2×SDS凝膠上樣緩沖液、二硫蘇糖醇（DTT）、震蕩器、泡沫板。

產(chǎn)品名稱：丙酮酸脫氫酶β(PDHb)重組蛋白

英文名稱：Recombinant Pyruvate Dehydrogenase Beta (PDHb)

PDH-B; PHE1B; PHE1-B; Pyruvate Dehydrogenase(lipoamide)Beta

型號(hào)：CS-D548

酶與激酶

物種：Homo sapiens (Human，人)

來源：原核表達(dá)

宿主E.coli

內(nèi)毒素水平：<1.0EU/μg(LAL法測(cè)定)

亞細(xì)胞定位：：線粒體

預(yù)測(cè)分子量：35.1kDa

實(shí)際分子量：35kDa(差異分析請(qǐng)參閱說明書)

片段與標(biāo)簽：Leu31~Asn341 with N-terminal His Tag

緩沖液成份：磷酸鹽緩沖液（pH7.4，含有 0.01% SKL, 1mM DTT, 5% Trehalose和Proclin300.）

性狀：凍干粉

純度：> 95%

等電點(diǎn)：5.6

應(yīng)用：Positive Control; Immunogen; SDS-PAGE; WB.

規(guī)格：10μg50μg200μg1mg5mg

a.制冰機(jī)制冰；

b.標(biāo)記筆將兩套EP管做好標(biāo)記；

c.將大冰盒、EP管盒裝上冰，一套標(biāo)記筆做好標(biāo)記的EP管放置于大冰盒中，另一套標(biāo)記筆做好標(biāo)記的EP管放置于EP管盒中，戴好手套，帶上EP管盒、眼科剪剪取黃豆大?。s100mg）新鮮組織或保存于-80℃冰箱組織；

d.取出保存于4℃冰箱的PBS，往EP管中滴加1ml PBS，眼科剪剪碎組織（動(dòng)作快），掌上離心，棄上清，再往EP管中滴加1ml PBS，研磨棒研磨，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘，棄上清，濾紙盡可能吸干管口殘留液體，估算EP管中沉淀物體積，以上步驟盡可能在冰上操作；

e.從4℃冰箱取出三去污裂解液，-20℃冰箱中取出PMSF置于大冰盒中，往EP管中滴加沉淀物3-5倍體積的三去污裂解液（一般為5倍）,再加入PMSF（二者比例為94：6）,研磨棒研磨（冰上充分裂解20-30分鐘），以上步驟均需在進(jìn)行；

f.離心機(jī)預(yù)冷，將充分裂解后的組織液4 ℃、10000轉(zhuǎn)離心10分鐘；

g.將燒杯用自來水洗凈，倒入單蒸水，電爐上煮沸；

h.備好2×SDS凝膠加樣緩沖液（存放于常溫），取出保存于-20℃冰箱的DTT,置于大冰盒中，將離心后的上清液用移液槍定量吸至另一套EP管中（勿吸取下層沉淀物），按上清液：2×SDS：DTT =1: 0.8:0.2加入2×SDS 及DTT，掌上離心，然后小心將EP管插入泡沫板，投入已煮沸的燒杯中煮6-8分鐘（電爐功率不要調(diào)太大，以免管蓋爆開）；

i. 將泡沫板用鑷子取出，置大冰盒中冷卻10分鐘，掌上離心，再放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>

注意：裂解液也可酌情選用單去污裂解液或細(xì)胞裂解液等。

2、貼壁細(xì)胞蛋白提取（細(xì)胞蛋白含量一般約為1x10-9mg/細(xì)胞）

1）所需器材：制冰機(jī)、細(xì)胞刮刀、標(biāo)記筆、兩套1.5ml EP管（高溫高壓處理）、兩個(gè)大冰盒、手套、長(zhǎng)滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶、保存于4℃冰箱的PBS、三去污裂解液、苯甲基磺酸氟（PMSF，一種蛋白酶抑制劑，劇毒）、移液槍、吸頭（高溫高壓處理）、濾紙、離心機(jī)、燒杯、4×SDS凝膠上樣緩沖液、二硫蘇糖醇（DTT）、泡沫板。