動(dòng)物血小板線粒體粗提分離試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書 

主要用途

動(dòng)物血小板線粒體粗提分離試劑是一種旨在通過(guò)低速差速離心和化學(xué)滲壓休克處理純化血小板、以及物理或化學(xué)破膜和高速差速離心的方法，直接從動(dòng)物血細(xì)胞中分離出完整而純化的血小板線粒體細(xì)胞器，然后進(jìn)一步生物酶處理以獲得高質(zhì)量的線粒體DNA的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。各種動(dòng)物血細(xì)胞中血小板線粒體核酸成分處理。用于后續(xù)的雜交、克隆、酶切、PCR分析等。產(chǎn)品即到即用，操作簡(jiǎn)易，性能穩(wěn)定，無(wú)核酶污染，萃取純度和產(chǎn)量皆高。

技術(shù)背景

線粒體細(xì)胞器的研究是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)的zui重要的課題之一。線粒體成為生物衰老、古生物、細(xì)胞凋亡、腫瘤、HIV、老年癡呆癥、糖尿病、肌肉疾病等研究的主要對(duì)象。線粒體DNA的分離和定量以及突變分析是研究中*的。 

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）   500毫升

裂解液（Reagent B）    80毫升

凈化液（Reagent C）    20毫升

強(qiáng)化液（Reagent D）    10毫升

保存液（Reagent E）   100毫升

破膜液（Reagent F）          6毫升

去干擾液（Reagent G）   600微升

酶解液（Reagent H）   600微升

萃取液（Reagent I）     6毫升

濃縮液（Reagent J）     2毫升

助沉液（Reagent K）    20微升

沉淀液（Reagent L）    20毫升

純化液（Reagent M）    20毫升

緩沖液（Reagent N）     1毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書 1份

保存方式

保存凈化液（Reagent C）、去干擾液（Reagent G）、酶解液（Reagent H）、萃取液（Reagent I）和助沉液（Reagent K）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

4℃（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

4℃超速離心機(jī)：用于樣品操作

DOUNCE勻漿器：用于裂解細(xì)胞

超聲儀：用于裂解細(xì)胞

58℃恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)物

實(shí)驗(yàn)步驟

• 血小板線粒體制備
• 物理處理法

實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent C）到4毫升的裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標(biāo)記為裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備1個(gè)無(wú)菌的50毫升錐形離心管
• 輕輕混勻10至20毫升新鮮（2小時(shí)內(nèi)抽取的靜脈血）的抗凝全血樣品
• 移入到50毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動(dòng)的細(xì)胞顆粒群
• 用手指輕彈離心管2至3下，使細(xì)胞顆粒群松動(dòng)
• 加入10毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液合并到上述50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動(dòng)的細(xì)胞顆粒群（扔掉含有細(xì)胞顆粒群的離心管）
• 放入含有上清液的離心管到臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動(dòng)的細(xì)胞顆粒群（扔掉含有細(xì)胞顆粒群的離心管）――此步驟獲得血小板富集血清
• 放入含有上清液的離心管到臺(tái)式離心機(jī)離心20分鐘，速度為2000g
• 可見白色沉淀顆粒群，小心抽掉上清液
• 加入10毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
• 放入臺(tái)式離心機(jī)離心20分鐘，速度為2000g
• 小心抽去上清液（注意：如果暫時(shí)停止操作，須暫時(shí)放進(jìn)－70℃冰箱里）――此步驟獲得純化的血小板
• 加入5毫升預(yù)冷的裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻細(xì)胞顆粒群
• 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿幫勻化細(xì)胞（約20至40下）（注意：參見注意事項(xiàng)11）
• 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）置于超聲儀槍頭下，離心管在冰槽里
• （選擇步驟）超聲功率為60％（或150赫茲）猝擊10秒，間隙30秒，10個(gè)循環(huán)
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
• 化學(xué)處理法

實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent C）到4毫升的裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標(biāo)記為裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備1個(gè)無(wú)菌的50毫升錐形離心管
• 輕輕混勻10至20毫升新鮮（2小時(shí)內(nèi)抽取的靜脈血）的抗凝全血樣品
• 移入到50毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動(dòng)的細(xì)胞顆粒群
• 用手指輕彈離心管2至3下，使細(xì)胞顆粒群松動(dòng)
• 加入10毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液合并到上述50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動(dòng)的細(xì)胞顆粒群（扔掉含有細(xì)胞顆粒群的離心管）
• （選擇步驟）放入含有上清液的離心管到臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為200g
• （選擇步驟）小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動(dòng)的細(xì)胞顆粒群（扔掉含有細(xì)胞顆粒群的離心管）――此步驟獲得血小板富集血清
• 放入含有上清液的離心管到臺(tái)式離心機(jī)離心20分鐘，速度為2000g
• 可見白色沉淀顆粒群，小心抽掉上清液
• 加入10毫升預(yù)冷的清理液(Reagent A)，混勻細(xì)胞顆粒群
• 放入臺(tái)式離心機(jī)離心20分鐘，速度為2000g
• 小心抽去上清液（注意：如果暫時(shí)停止操作，須暫時(shí)放進(jìn)－70℃冰箱里）――此步驟獲得純化的血小板
• 入5毫升預(yù)冷的裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入500微升預(yù)冷的強(qiáng)化液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項(xiàng)12）
• 加入5毫升預(yù)冷的保存液（Reagent E），輕輕搖動(dòng)試管混勻
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物

• 線粒體DNA萃取
• 加入300微升破膜液（Reagent F）到線粒體顆粒樣品中
• 渦旋震蕩15秒，混勻顆粒群
• 轉(zhuǎn)入1.5毫升離心管
• 置入冰槽中孵育15分鐘 
• 加入30微升去干擾液（Reagent G）
• 用200微升槍頭上下抽吸混勻
• 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育15分鐘
• 加入30微升酶解液（Reagent H）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進(jìn)58℃恒溫水槽或干式恒溫儀孵育2小時(shí)（注意：可以孵育4至16小時(shí)，增加萃取產(chǎn)量） 
• 置于室溫下冷卻15分鐘，直至處于室溫狀態(tài)（或置于冰槽里15至30秒）
• 加入300微升萃取液（Reagent I）（注意：使用前搖勻）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管（注意：切莫觸碰液相交界面上的白色膜狀物）
• 加入100微升濃縮液（Reagent J）
• 加入1微升助沉液（Reagent K）
• 加入800微升沉淀液（Reagent L）
• 在渦旋震蕩儀上震蕩15秒，充分混勻
• 放進(jìn)微型臺(tái)式微型離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標(biāo)記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升純化液（Reagent M）
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入20微升緩沖液（Reagent N）
• 溶解后放進(jìn)－20℃冰箱保存或移出2微升進(jìn)行PCR反應(yīng)

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次（10至20毫升全血/次）操作
• 其它實(shí)際操作的全血容量與試劑使用量按比例調(diào)整：例如40毫升全血，試劑用量加倍
• 操作時(shí)，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）
• 操作時(shí)，須戴手套
• 建議使用新鮮全血：2小時(shí)內(nèi)的全血為理想狀態(tài)，不要超過(guò)24小時(shí)
• 全血樣品采集須使用全血樣品采集須使用EDTA二鉀血液抗凝液（ 12059.1）、ACD血液抗凝液（ 12059.4），或肝素鈉血液抗凝液（ 12059.5）
• 建議使用足夠的樣品量
• 血小板提取量因人而異；如果不足，建議增加全血量
• 線粒體操作均須在4℃或以下狀態(tài)下進(jìn)行
• 建議嚴(yán)格控制操作時(shí)間
• 通常勻化次數(shù)為20至40下（或細(xì)胞顆粒群消失為止）達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)。用戶可以通過(guò)顯微鏡觀察3微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)
• 通常孵育5分鐘（不宜超過(guò)5分鐘）達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)。用戶可以通過(guò)顯微鏡觀察3微升裂解物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時(shí)間和渦旋震蕩次數(shù)
• 物理處理法是優(yōu)先推薦的技術(shù)處理
• 通常每毫升全血平均可獲得2 X 10⁸血小板
• 通常10毫升全血的血小板線粒體含量為10至25微克線粒體蛋白
• 可以通過(guò)增加線粒體溶解時(shí)間（30分鐘）和酶解時(shí)間（直至16小時(shí)），獲得大量的DNA產(chǎn)量
• 從2.5 X10⁸細(xì)胞中提取的線粒體DNA通常達(dá)1微克
• 本產(chǎn)品所獲得的線粒體DNA純度和產(chǎn)量zui為理想，確保無(wú)核DNA和外源性DNA污染
• 本公司提供系列線粒體試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無(wú)核酶污染
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定萃取產(chǎn)量和純化程度高
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無(wú)基因組DNA污染