動(dòng)物細(xì)胞/組織核糖體分離試劑盒產(chǎn)品說明書 主要用途 動(dòng)物細(xì)胞/組織核糖體分離試劑是一種旨在通過物理破壁和化學(xué)破膜以及等密度超速離心處理方法，分離出完整而純化的80S核糖體組分的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適合于各種新鮮或凍存的動(dòng)物和人體細(xì)胞或組織胞漿核糖體成分的分離。產(chǎn)品即到即用，操作簡(jiǎn)易，性能穩(wěn)定，無核酶和蛋白酶污染，萃取純度和產(chǎn)量皆高。 技術(shù)背景 核糖體（ribosome）是一種細(xì)小顆粒的核糖蛋白復(fù)合物（ribonucleoprotein complex），生命細(xì)胞制造蛋白質(zhì)的非膜性結(jié)構(gòu)元素和轉(zhuǎn)譯裝置（translational apparatus），由RNA和蛋白質(zhì)組成，具有多肽轉(zhuǎn)移酶的活性。其分成2個(gè)亞體：大亞體和小亞體。核糖體通過大亞體結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)核糖體（tRNA），而小亞體結(jié)合信使RNA（mRNA），然后閱讀RNA提供的信息，轉(zhuǎn)譯（translation）成氨基酸，連接成蛋白分子。真核生物的核糖體位于胞漿（游離核糖體）、線粒體和葉綠體中。其中胞漿核糖體為80S核糖體，由40S小亞體和60S大亞體組成：60S由5S RNA、28S RNA、5.8S亞基和49個(gè)蛋白組成；而40S由18S RNA和33個(gè)蛋白組成。線粒體和葉綠體核糖體與原核生物相似，為70S核糖體，由30S小亞體和50S大亞體組成：50S包括5S、23S RNA和34個(gè)蛋白；30S包括16S RNA和21個(gè)蛋白。 產(chǎn)品內(nèi)容 清理液（Reagent A） 毫升 裂解液（Reagent B） 毫升 分離液（Reagent C） 毫升 保存液（Reagent D） 毫升 產(chǎn)品說明書 1份 保存方式 保存裂解液（Reagent B）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月 用戶自備 HANK平衡鹽緩沖溶液（HL12028）或PBS緩沖溶液（HL12033）：用于清理細(xì)胞 胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（HL12024）：用于細(xì)胞脫離 *細(xì)胞培養(yǎng)液（HL12052）：用于中和胰蛋白酶的細(xì)胞培養(yǎng)基 50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器 15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器 1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器 臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作 超速離心機(jī)：用于樣品操作 DOUNCE勻漿器：用于裂解細(xì)胞 渦旋震蕩儀：用于混勻 實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒里的試劑置于冰槽里凍融備用。然后進(jìn)行下列操作。 一、細(xì)胞核糖體分離 1．準(zhǔn)備5至10瓶75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（5 X 107），直至細(xì)胞生長鋪滿整個(gè)培養(yǎng)表面 2．分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去 3．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟2一次 4．加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)培養(yǎng)平面 5．置入37℃培養(yǎng)箱3分種 6．輕輕手擊震動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落 7．分別加入10毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液 8．移入一個(gè)50毫升錐形離心管 9．放入臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g 10．小心抽去上清液 11．加入xx毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞 12．放入臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g 13．小心抽去上清液 14．加入預(yù)冷的xx毫升裂解液（Reagent B） 15．渦旋震蕩5秒，充分混勻 16．即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器 17．置于冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）（注意：未見組織塊） 18．將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管 19．放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g 20．小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管 21．放進(jìn)－70℃冰箱里備用或放進(jìn)冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作 22．移取xx毫升分離液（Reagent C）到8毫升超速離心管 23．小心沿著管壁，在分離液（Reagent C）上面，一滴一滴加入4毫升上述獲得的后線粒體組分 （注意：避免晃動(dòng)，同時(shí)離心前，使用礦物油填滿離心管） 24．小心放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心2小時(shí)，速度為260000g 25．小心取出離心管 26．小心抽去上清液 27．加入xx毫升保存液（Reagent D），混勻顆粒群 28．轉(zhuǎn)移到到新的1.5毫升離心管 29．（選擇步驟）進(jìn)行核糖體定量測(cè)定 30．放進(jìn)－70℃冰箱里保存或置于冰槽里準(zhǔn)備后續(xù)操作 二、組織核糖體分離 1．準(zhǔn)備好新鮮或凍存的動(dòng)物組織，并秤重以確定1至2克組織重量 2．（選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管 3．（選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次 4．移入一個(gè)液氮凍存管 5．即刻放進(jìn)液氮罐過夜 6．次日從液氮罐里取出，即刻（zui快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融） 7．放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15毫升錐形離心管 8．加入預(yù)冷的xx毫升裂解液（Reagent B） 9．渦旋震蕩5秒，充分混勻 10．即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器 11．置于冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）（注意：未見組織塊） 12．將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管 13．放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g 14．小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管 15．放進(jìn)－70℃冰箱里備用或放進(jìn)冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作 16．移取xx毫升分離液（Reagent C）到8毫升超速離心管 17．小心沿著管壁，在分離液（Reagent C）上面，一滴一滴加入4毫升上述獲得的后線粒體組分 （注意：避免晃動(dòng)，同時(shí)離心前，使用礦物油填滿離心管） 18．小心放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心2小時(shí)，速度為260000g 19．小心取出離心管 20．小心抽去上清液 21．加入xx毫升保存液（Reagent D），混勻顆粒群 22．轉(zhuǎn)移到到新的1.5毫升離心管 23．（選擇步驟）進(jìn)行核糖體定量測(cè)定 24．放進(jìn)－70℃冰箱里保存或置于冰槽里準(zhǔn)備后續(xù)操作 注意事項(xiàng) 1．本產(chǎn)品為10次操作（1克動(dòng)物組織或5 X 107細(xì)胞/次） 2．建議使用足夠的組織或細(xì)胞量 3．樣品操作均須在4℃或以下狀態(tài)下進(jìn)行 4．操作時(shí)，須無菌操作，避免污染母液 5．核糖體定量計(jì)算公式（微克/微升）： A260 11.1 6．如果進(jìn)行核糖體蛋白萃取，建議使用純化核糖體蛋白質(zhì)萃取試劑盒—HL16041 7．本公司提供系列核糖體分析技術(shù)產(chǎn)品 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 1．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定 2．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的核糖體維持正常活性 3．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶