基本概述編輯
96孔細胞培養(yǎng) 吸液
96孔細胞培養(yǎng) 吸液
細胞的生長需要營養(yǎng)環(huán)境，用于維持細胞生長的營養(yǎng)基質稱為培養(yǎng)基。培養(yǎng)基按其物理狀態(tài)可分為液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基用于大規(guī)模的工業(yè)生產以及生理代謝等基本理論的研究工作。液體培養(yǎng)基中加入一定的凝固劑（如瓊脂）或固體培養(yǎng)物（如麩皮、大米等）便成為固體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基為細胞的生長提供了一個營養(yǎng)及通氣的表面，在這樣一個營養(yǎng)表面上生產的細胞可形成單個菌落。因此，固體培養(yǎng)基在細胞的分離、鑒定、計數(shù)等方面起著相當重要的作用。從多細胞生物中分離所需要細胞和擴增獲得的細胞以及對細胞進行體外改造，觀察，必須解決細胞離體培養(yǎng)問題，同微生物細胞培養(yǎng)的難易相比，比較困難的是來自多細胞生物的單細胞培養(yǎng)，特別是動物細胞的培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)泛指所有體外培養(yǎng)，其含義是指從動物活體體內取出組織，于模擬體內生理環(huán)境等特定的體內條件下，進行孵育培養(yǎng)，使之生存并生長。細胞培養(yǎng)工作現(xiàn)已廣泛應用于生物學、醫(yī)學、新藥研發(fā)等各個領域，成為重要的基礎科學之一。 [1] 
設施器材編輯
設施：超凈臺、恒溫培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、液氮儲存罐、電熱鼓風干燥箱、冰柜、電子天平、恒溫水浴槽、離心機、壓力蒸汽消毒器。
器材：
一、玻璃器材
無菌室
無菌室
培養(yǎng)皿、滴流瓶、刻度吸管、離心管、培養(yǎng)瓶、燒杯、量筒、三角燒瓶
二、塑料器材
多孔培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶
三、橡皮器材
橡皮制品（好是硅制品）做各種瓶或試管的塞子、蓋子。
四、金屬器材
剪刀、鑷子、手術刀、解剖刀、血管鉗、組織鑷、眼科鑷及各種型號針頭
五、其他物品
紗布、注射器和針頭
培養(yǎng)基編輯
幾種常用細胞培養(yǎng)基產品
⒈ BME（basal medium eagle）基礎伊格培養(yǎng)基
⒉ MEM
⒊ DMEM
⒋ IMDM
⒌ RPMI-1640
⒍ M199
⒎ Mccoy's 5A
⒏ F10 F12 DMEM混合F12（三）幾種常用細胞培養(yǎng)配套試劑的配置（緩沖液、平衡鹽溶液等）
1、無鈣、鎂、離子溶液（1000ml)
化鈉（NaCl)8g磷酸二氫鈉、（NaH2PO4H20）0.05g、化鉀（KCl)0.2g、碳酸氫鈉（NaHCO3）1g、檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7,H20）1g、葡萄糖1g、加去離子水或雙蒸水至1000mL
2、PBS（Phosphate-Buffered saline）磷酸鹽緩沖液
甲液：0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液、磷酸氫二鈉（無水）28.4g、化鈉8.77g加去離子水或雙蒸水至1000mL
乙液：0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液、磷酸二氫鈉（無水）2.4g、化鈉8.77g加去離子水或雙蒸水至1000mL
甲、乙液于4℃保存，使用時按表3-2所示比例，配制成所需pH濃度，高壓滅菌后室溫保存。
3、Hanks液（HBSSHank‘s Balanced salt solution)
⑴母液甲（20x）配法
①NaCl(A.R)160g、KCl(A.R)8g、MgSO4.7H2O（A.R)2g、MgCl.6H2O(A.R)2g依次溶于800mL雙蒸水中，前一物質溶后再加后一種。
②CaCl2(A.R)2.8g溶于100mL雙蒸水中，溶時不斷攪拌（此液應單配，單溶）。
待上述兩溶液中的“溶質”全溶后，將它們混合，再用雙蒸水補至1000mL，向其中加2mL仿作為防腐劑，置4℃保存。
⑵母液乙（20×）配法
①Na2HPO4.12H2O(A.R)3.04g、KH2PO4(A.R)1.20g、葡萄糖（A.R)20.0g溶于800ml雙蒸水中。
②0.4%酚紅液0.4g酚紅放在玻璃研缽后加0.01N、NaOH11.28mL，直到全部溶解，移入100mL容量瓶中，加水至100mL，過濾，pH為7.4，4℃保存。
待上述各“溶質”*溶解后，用雙蒸水補至1000mL,其中加仿2mL作防腐劑，置40℃保存。
3）使用液（1×）配法
取母液甲和母液乙各一份，加雙蒸水18份，分裝后，塞好瓶塞，掛上標志。以115℃高壓滅菌25分鐘（以免葡萄糖破壞），置室溫后4℃保存，可使用幾個月。臨用前，用7.5%NaHCO3調至所需pH。
4、Eagle's液（EBSSEagle's Balanced salt solution)
是一種在二氧化碳（CO2）環(huán)境中短期維持細胞活性的平衡鹽溶液，可用于細胞解離前的清洗、細胞或組織的運輸、細胞計數(shù)時稀釋、溶液的配置等。
5、HEPES液
生物緩沖液，化學性質穩(wěn)定，在PH7.2~7.6范圍內，比NaHCO3緩沖液的緩沖能力更強。
6、NaHCO3緩沖液
常規(guī)緩沖體系的一部分，但是不穩(wěn)定，易受空氣中CO2的含量而改變PH值，影響緩沖效果。
具體步驟編輯
一、復蘇 [1] 
1.把凍存管從液氮中取出來，立即投入37℃水浴鍋中，輕微搖動（注意防止蓋子不緊致使液體進入凍存管）。液體都融化后(大概1-1.5分鐘)，拿出來噴點酒精放到超凈工作臺里。
2.把上述細胞懸液吸到裝10ml培養(yǎng)基的15ml的離心管中(用培養(yǎng)基把凍存管洗一遍，把粘在壁上的細胞都洗下來)，1000轉離心5分鐘。
3.把上清液倒掉，加1ml培養(yǎng)基把細胞懸浮起來。吸到裝有10ml培養(yǎng)基的10cm培養(yǎng)皿中前后左右輕輕搖動，使培養(yǎng)皿中的細胞均勻分布。
4.標好細胞種類和日期、培養(yǎng)人名字等，放到37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁后換培養(yǎng)基。
5.根據(jù)細胞增長速度2-3天換一次培養(yǎng)基。
二、傳代
1.培養(yǎng)皿中的細胞覆蓋率達到80%-90%時要傳代。
2.把原有培養(yǎng)基吸掉。
3.加適當?shù)囊鹊鞍酌?能覆蓋細胞就行)，消化1-2分鐘。
4.細胞都變圓后加入等體積的含血清的培養(yǎng)基終止消化。
5.用移液槍吹打細胞，讓細胞懸浮起來。
6.把細胞吸到10ml或15ml的離心管中，1000轉離心5分鐘。
7.倒掉上清液，加1-2ml培養(yǎng)基，把細胞都吹起來。
8.根據(jù)細胞種類把細胞傳到幾個培養(yǎng)皿中。一般，癌細胞分5個，正常細胞傳3個。繼續(xù)培養(yǎng)。
三、凍存
把細胞消化下來并離心(同上)。用配好的凍存液把細胞懸浮起來，分裝到滅菌的凍存管中，靜止幾分鐘，寫明細胞種類，凍存日期。4℃30min，-20℃30min，-80℃過夜，然后放到液氮灌中保存。
凍存液的配制：70%的*培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。
一般過程編輯
一、準備工作
準備工作對開展細胞培養(yǎng)異常重要，工作量也較大，應給予足夠的重視，準備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導致實驗失敗或無法進行。準備工作的內容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調試，具體內容可參閱有關文獻。
二、取材
在無菌環(huán)境下從機體取出某種組織細胞（視實驗目的而定），經(jīng)過一定的處理（如消化分散細胞、分離等）后接入培養(yǎng)器皿中，這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養(yǎng)則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的*培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。理論上講各種動物和人體內的所有組織都可以用于培養(yǎng)，實際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。取材后應立即處理，盡快培養(yǎng)，因故不能馬上培養(yǎng)時，可將組織塊切成黃豆般大的小塊，置4℃的培養(yǎng)液中保存。取組織時應嚴格保持無菌，同時也要避免接觸其他的有害物質。取病理組織和皮膚及消化道上皮細胞時容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。由組織并分離分散細胞的方法可參閱有關文獻。
三、培養(yǎng)
將取得的組織細胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。如系組織塊培養(yǎng)，則直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部，幾個小時后組織塊可貼牢在底部，再加入培養(yǎng)基。如系細胞培養(yǎng)，一般應在接入培養(yǎng)器皿之前進行細胞計數(shù)，按要求以一定的量（以每毫升細胞數(shù)表示）接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細胞進入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細胞盡早進入生長狀態(tài)。正在培養(yǎng)中的細胞應每隔一定時間觀察一次，觀察的內容包括細胞是否生長良好，形態(tài)是否正常，有無污染，培養(yǎng)基的PH是否太酸或太堿（由酚紅指示劑指示），此外對培養(yǎng)溫度和CO2濃度也要定時檢查。一般原代培養(yǎng)進入培養(yǎng)后有一段潛伏期（數(shù)小時到數(shù)十天不等），在潛伏期細胞一般不分裂，但可貼壁和游走。過了潛伏期后細胞進入旺盛的分裂生。細胞長滿瓶底后要進行傳代培養(yǎng)，將一瓶中的細胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱為“一代”。二倍體細胞一般只能傳幾十代，而轉化細胞系或細胞株則可無限地傳代下去。轉化細胞可能具有惡性性質，也可能僅有不死性（Immortality）而無惡性。培養(yǎng)正在生長中的細胞是進行各種生物醫(yī)學實驗的良好材料。
四、凍存及復蘇
為了保存細胞，特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株，要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度—－196℃，將細胞收集至凍存管中加入含保護劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，終保存于液氮中。在極低的溫度下，細胞保存的時間幾乎是無限的。復蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內迅速融解。然后將細胞轉入培養(yǎng)器皿中進行培養(yǎng)。凍存過程中保護劑的選用、細胞密度、降溫速度及復蘇時溫度、融化速度等都對細胞活力有影響。 [2] 
一般條件編輯
簡言之，即細胞需要什么就提供什么，道理是如此，真正能做到這點尚需時日，人們至今對細胞的生命周期控制機理認識不足，癌細胞雖然也來自正常細胞，但至今不知道究竟為什么癌細胞很難停止已經(jīng)啟動的有害分裂，盡管如此，人們的研究結果表明，離體細胞培養(yǎng)需要的基本條件就是下列細胞生理條件。
⑴溫度
溫度過低時細胞生長緩慢甚至不生長。利用冷凍保藏細胞可保持細胞的原有分裂分化能力。溫度過高導致細胞死亡。這主要是由酶和蛋白質所需要的適溫度決定的。多數(shù)生物大分子遇到高溫后容易導致空間結構改變或者喪失（變性）。細胞膜遇到高溫后容易態(tài)。在自然界，既有耐高溫的
恒溫培養(yǎng)箱
恒溫培養(yǎng)箱
細胞，也有耐低溫的細胞。在情況下生長的生物對付環(huán)境的機制研究在生物進化和農業(yè)、環(huán)保、發(fā)酵工業(yè)中意義重大。
⑵pH
過酸或過堿可導致細胞死亡。這主要與蛋白質的變性和細胞膜的結構受損有關。
⑶滲透壓
細胞內外可溶于水的物質比例和種類決定細胞的膨脹與收縮程度，因為細胞膜是半透膜，只允許對自己有利的物質通過。同一物質在細胞內外的分布的數(shù)量不同，當某一種極溶于水的物質在細胞外濃度過大時，有可能導致細胞干癟死亡，這些物質在細胞內過多時導致細胞過量吸水膨脹。細胞膜調節(jié)滲透壓的能力是有限的。
⑷營養(yǎng)物
營養(yǎng)物和水一起，又叫細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中含有細胞增殖和生長所需要的各種物質。營養(yǎng)物包括：N 源、C源，這些物質與提供能量有關；無機鹽、維生素、激素，這些物質與代謝調節(jié)控制有關。細胞培養(yǎng)液的設計一直是細胞離體培養(yǎng)技術的關鍵。理想的細胞培養(yǎng)液可以同時解決細胞離體培養(yǎng)所需要的pH、滲透壓、營養(yǎng)物、調節(jié)物質的全部需要。在干細胞分化研究與應用中，關鍵是找到一種使干細胞分化成為所需細胞和組織的營養(yǎng)液。相同的人干細胞，放在不同的營養(yǎng)液中分化培養(yǎng)出人的各種臟器，這個昔日的夢想已經(jīng)開始成為現(xiàn)實。植物細胞的組織培養(yǎng)技術已經(jīng)基本完善配套。名貴花卉、中草藥、脫毒馬鈴薯、組織培養(yǎng)蓮菜苗等植物細胞與組織培養(yǎng)技術的不斷完善，特別是由于組織培養(yǎng)液的商品化已經(jīng)被廣大農民普遍接受。
⑸水
水是細胞需要數(shù)量大的物質，不同的物種、不同部位、不同生的細胞含水量差別相當大。干旱植物細胞的含水量高達90%。水的需求量一般隨同細胞培養(yǎng)液一起考慮。
⑹無菌條件
體外細胞培養(yǎng)僅僅是對所需的細胞進行培養(yǎng)，但環(huán)境中（如空氣）有各種其他微生物，必須對所需細胞進行無雜菌的隔離培養(yǎng)。無菌條件是細胞離體培養(yǎng)基本的條件。
⑺光
植物細胞和少數(shù)細菌需要利用光進行光合作用。
⑻氣體
動物細胞需要不斷供給氧氣和排除二氧化碳，植物細胞與此相反。
二氧化碳的作用：調節(jié)pH，有緩沖作用，沒有刺激動物細胞呼吸的功能 [2] 
培養(yǎng)條件編輯
動物細胞培養(yǎng)
在所有的細胞離體培養(yǎng)中，困難的是動物細胞培養(yǎng)。下面是它所需要的特殊條件。
⑴血清：動物細胞離體培養(yǎng)常常需要血清。常用的是小牛血清。血清提供生長必需因子，如激素、微量元素、礦物質和脂肪。有一天人們真正學會了配制和血清一樣的培養(yǎng)液，那時血清才可被取代。在這里，血清等于是動物細胞離體培養(yǎng)的天然營養(yǎng)液。
⑵支持物：大多數(shù)動物細胞有貼壁生長的習慣。離體培養(yǎng)常用玻璃，
高速冷凍離心機
高速冷凍離心機
塑料等作為支持物。
⑶氣體交換：二氧化碳和氧氣的比例要在細胞培養(yǎng)過程中不斷進行調節(jié)，不斷維持所需要的氣體條件，每一次開箱操作后的快速恢復對設備的要求可想而知有多難？由此決定了動物細胞離體培養(yǎng)設備要求高、投資大。
植物細胞培養(yǎng)
⑴光照：離體培養(yǎng)的植物細胞對光照條件不甚嚴格，因為細胞生長所需要的物質主要是靠培養(yǎng)基供給的。但光照不但與光合作用有關，而且與細胞分化有關，例如光周期可對性細胞分化和開花調控作用，所以以獲得植株為目的的早期植物細胞培養(yǎng)過程中，光照條件特別重要。以植物細胞離體培養(yǎng)方式獲得重要物質，如藥物的過程，植物細胞大多是在反應器中懸浮培養(yǎng)。
⑵激素：植物細胞的分裂和生長特別需要植物激素的調節(jié)，促進生長的生長素和促進細胞分裂的分裂素是基本的激素。植物細胞的分裂，生長，分化和個體生長周期都有相應的激素參與調節(jié)。和動物細胞相比，植物細胞離體培養(yǎng)對激素要求的原理已經(jīng)了解，其應用技術也已相當成熟，已經(jīng)有一套廣泛作為商品使用的培養(yǎng)液。同時解決了植物細胞對水、營養(yǎng)物、激素、滲透壓、酸堿度、微量元素等的需求。
微生物細胞培養(yǎng)
微生物多為單細胞生物，野生生存條件比較簡單。所以微生物人工培養(yǎng)的條件比動植物細胞簡單得多。其中厭氧微生物培養(yǎng)比好氧微生物復雜，因為嚴格厭氧需要維持二氧化碳等非氧的惰性氣體濃度，而好氧微生物則只需要通過不斷攪拌提供無菌氧氣。微生物對培養(yǎng)條件要求不如動植物細胞那樣苛刻，玉米漿、蛋白胨、麥芽汁、酵母膏等成為良好的微生物天然培養(yǎng)基。對于一些特殊微生物的營養(yǎng)條件要求，可以在這些天然培養(yǎng)基的基礎上額外添加。
注意事項編輯
1、實驗進行前，無菌室及無菌操作臺（laminarflow）以紫外燈照射30-60分鐘滅菌，以70%乙醇擦拭無菌操作臺面，并開啟無菌操作臺風扇運轉10分鐘后，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70%ethanol擦拭無菌操作臺面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10分鐘以上后，再進行下一個細胞株的操作。
2、無菌操作工作區(qū)域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70%ethanol擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在臺面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。
3、小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開的容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4、工作人員應注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當?shù)燃壷疅o菌操作臺（至少ClassⅡ）。操作過程中，應避免引起aerosol之產生，小心毒性藥品，例如DMSO及TPA等，并避免尖銳針頭之傷害等。
5、定期檢測下列項目：5.1CO2鋼瓶之CO2壓力5.2CO2培養(yǎng)箱之CO2濃度、溫度、及水盤是否有污染（水盤的水用無菌水，每周更換）。5.3.無菌操作臺內之airflow壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA過濾膜，預濾網(wǎng)（300小時/預濾網(wǎng)，3000小時/HEPA）。6.水槽可添加消毒劑(Zephrin1:750），定期更換水槽的水
6、粉末培養(yǎng)基配制好后（加了血清），一般在4度盡量不要超過1個月，如在-20度存放時間可長一些，但好也不要超過3-4個月，可能對于永生化細胞株來說要求不是太高，細胞嬌弱，放置時間不宜過長。
7、開紫外線照射臺的時候，就將培養(yǎng)基、酶、DHANKS液那到室外讓它自然升溫。這樣40分鐘后，溫度也升上來了。有很多人將其放到37度水浴鍋里加熱。一定要注意水浴鍋的衛(wèi)生，有的常年不清洗，里面很臟，容易在外面瓶身上吸附大量細菌。因此用時也一定要勤換水。從水浴鍋拿出后，好找個毛巾擦干上面的水。
意義編輯
⒈可以進行植物體外受精及 植物胚胎發(fā)育過程研究。
⒉可以進行植物生長發(fā)育有關的重要基因或影響因素的研究。
⒊可以方便地通過實驗手段培育植物新品種。
方式編輯
群體培養(yǎng)
大量細胞置于同一培養(yǎng)瓶中進行貼壁或懸浮培養(yǎng)。
克隆培養(yǎng)
挑選單個細胞或單一集落（克?。┯隗w外進行培養(yǎng)。常用于細胞克隆化（純化），建立細胞株，傳代。
優(yōu)點編輯
1、能傳代，保持活性，便于監(jiān)控檢測結構功能和生命活動。
2、培養(yǎng)條件可以人為的控制便于研究細胞代謝、物理、化學、生物因素的影響
3、可用于各種觀察和檢測手段研究活細胞的變化（變異、分化）?？蓮募毎介_展亞細胞結構和代謝分子的表達。
4、研究范圍和細胞來源廣泛，選擇性廣。
5、不同代次細胞可保存，既可開展同代次不同條件和方法研究，又可觀察不同代次的動態(tài)變化。
6、耗資少、經(jīng)濟、成本低、可大量培養(yǎng)，利于生物制品的生產。
不足編輯
細胞或組織生長在人工環(huán)境中，與體內環(huán)境存在差異，細胞或組織的形態(tài)或功能會發(fā)生不同程度的改變。