目的:總結(jié)并改進(jìn)細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)的操作經(jīng)驗(yàn)。結(jié)果:改進(jìn)后侵襲試驗(yàn)定位準(zhǔn)確，結(jié)果清晰。結(jié)論：按照作者建議的方法操作，能夠縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間,有助于提高細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量。
細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)主要應(yīng)用于各種細(xì)胞因子對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響及一些抑制血管生成的新藥研究,但在具體實(shí)驗(yàn)中獲得真實(shí)、佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖像,并借以說明問題并非簡(jiǎn)單。
很多研究人員在此方面花費(fèi)了很多時(shí)間和科研經(jīng)費(fèi),從刺激實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞到蘇木素染色,看似簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)步驟中有很多環(huán)節(jié)需要研究者注意.
材料與方法編輯
1. 1
Matrigel：Becton Dickinson Compary, - 20 ℃保存；
Transwell plate：Costar ,USA , # 3422 ,聚碳酯膜微孔直徑為8μm；
蘇木素染液，梯度乙醇，二甲苯溶液。
1. 2 趨化因子的制備 取傳代第二天長(zhǎng)勢(shì)良好的NIH3T3細(xì)胞,無血清培養(yǎng)基輕柔漂洗兩次; 加入無血清培養(yǎng)基,37℃,5 %CO2 培養(yǎng)24 h～48h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清；4 ℃,12 000rpm 離心,10 min ,取上清；0.22 μm 濾膜過濾除菌；分裝,在- 20 ℃保存。
1. 3
transwell 培養(yǎng)板準(zhǔn)備 所有操作均需無菌操作。-20℃保存的Matrigel 在冰上保2℃～8℃過夜融化。在冰上用預(yù)冷的槍頭吸取100μl Matrigel 加入冰預(yù)冷的300μl 無血清培養(yǎng)基中,充分混均。取上述稀釋的Matrigel 25 μl 加入transwell 板上室,覆蓋整個(gè)聚碳酯膜,37 ℃,30 min ,使Matrigel 聚合成膠。已鋪好Matrigel的transwell 培養(yǎng)板置于37℃可保存2 周。
1. 4
Matrigel 侵襲實(shí)驗(yàn)(Matrigel Invasion Assay)刺激后的各組細(xì)胞用PBS 漂洗3 次。以常規(guī)方法用無血清培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液,5 ×105個(gè)細(xì)胞/ ml ,每組細(xì)胞各分為兩部分。胎盤蘭拒染實(shí)驗(yàn),細(xì)胞活力需大于95 %。Transwell 培養(yǎng)板上室加入100μl 細(xì)胞懸液( 5 ×104 個(gè)) 并加入無血清培養(yǎng)基200 ul 。Transwell 培養(yǎng)板下室加入500μl 趨化因子,37℃,5 %CO2 培養(yǎng)24 h。
用濕棉簽輕輕擦去Matrigel 凝膠和聚碳酯膜上表面的細(xì)胞。小心取出上室,用線拴住,并做好標(biāo)記,用冰預(yù)冷的甲醇固定30 min。蘇木素染色1 min。
梯度乙醇脫水(80 % ,95 % ,100 %) ,二甲苯透明。小心將聚碳酯膜自上室基底切取下來,置載玻片上中性樹脂封片。附著于聚碳酯膜下表面的細(xì)胞在高倍鏡下( ×400) 隨機(jī)取6 個(gè)視野[1 ] 計(jì)數(shù),取平均數(shù)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)兩次。
注意事項(xiàng)編輯
2. 1
NIH3T3 細(xì)胞制備的趨化因子與胎牛血清 趨化因子是能使細(xì)胞產(chǎn)生趨化運(yùn)動(dòng)的一類細(xì)胞因子[2 ] 。目前利用NIH3T3 細(xì)胞制備趨化因子做細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室比較多,時(shí)間較長(zhǎng)且實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣。*,胎牛血清中有趨化因子,我們?cè)诓煌瑵舛萒NFα刺激下的HCCC29810 膽囊癌細(xì)胞體外侵襲能力的強(qiáng)弱實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用胎牛血清和用NIH3T3 細(xì)胞制備的趨化因子做細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)效果是一樣的,兩組遷移的細(xì)胞數(shù)很接近。
在實(shí)驗(yàn)時(shí)間上，用NIH3 T3細(xì)胞制備趨化因子做細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)周期為1 周,而用胎牛血清作趨化因子做細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)周期為2 d ,實(shí)驗(yàn)時(shí)間節(jié)省了很多。因此認(rèn)為可以用胎牛血清來代替NIH3T3 細(xì)胞制備的趨化因子。
2. 2 細(xì)胞的準(zhǔn)備 所需細(xì)胞應(yīng)處在對(duì)數(shù)生,細(xì)胞活力需大于95 %。如果細(xì)胞活力小,就會(huì)造成細(xì)胞穿透能力下降,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
2. 3 擦去Matrigel 凝膠和聚碳酯膜上表面的細(xì)胞 先用干棉簽將上室內(nèi)液體吸去,再用蒸餾水浸濕的棉簽輕輕擦去Mat rigel 凝膠和聚碳酯膜上表面的細(xì)胞,如果沒有擦凈聚碳酯膜上表面的細(xì)胞,在細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)就會(huì)將沒擦掉的細(xì)胞也計(jì)進(jìn)來。尤其是細(xì)胞為圓形的時(shí)候,就會(huì)分辨不出是穿過去的細(xì)胞還是沒穿過去的細(xì)胞,對(duì)于長(zhǎng)梭形細(xì)胞來說,穿過去的細(xì)胞為長(zhǎng)梭形,沒穿過去的細(xì)胞多為圓形。
2. 4 蘇木素染色 上室浸泡在新蘇木素中的時(shí)間為1 min ,用過多次的蘇木素為2 min。在研究粉防己堿對(duì)HUVEC 人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的抑制作用沒有將多余蘇木素洗去,直接脫水、透明,造成細(xì)胞圖片背景模糊,細(xì)胞不清楚。
在作不同濃度TNFα刺激下的HCCC29810 膽囊癌細(xì)胞體外侵襲能力的強(qiáng)弱實(shí)驗(yàn)時(shí)我們將其置于盛有自來水的燒杯中,反復(fù)漂洗幾次,將多余蘇木素洗去再行脫水、透明;這樣做出的細(xì)胞圖片背景干凈,細(xì)胞清楚。
2. 5 脫水和透明時(shí)間 脫水時(shí)間各為1 min ,在二甲苯中的時(shí)間不要過長(zhǎng),以2 min～3 min 為宜;尤其是同時(shí)操作多個(gè)樣本時(shí),時(shí)間過長(zhǎng)就會(huì)造成部分聚碳酯膜從上室基底部自動(dòng)脫落下來,上室間粘連在一起,造成樣本混淆,實(shí)驗(yàn)失敗。建議在后一步實(shí)驗(yàn)時(shí)需二人協(xié)做,一人辨別并取出樣本,一人小心將聚碳酯膜自上室基底切取下來,置載玻片上中性樹脂封片并及時(shí)編號(hào)。
2. 6 細(xì)胞計(jì)數(shù) 當(dāng)實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞為圓形時(shí),實(shí)驗(yàn)人員容易將聚碳酯膜上小孔誤認(rèn)為細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。我們?cè)谧鱒EGF 對(duì)人結(jié)腸癌HT229 細(xì)胞體外侵襲能力的影響時(shí),發(fā)現(xiàn)HT229細(xì)胞很小,很容易將聚碳酯膜上小孔誤認(rèn)為細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù) 。