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上海威正翔禹生物科技有限公司
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閱讀：5308發(fā)布時間：2017-10-23
細胞培養(yǎng)是常見的生物醫(yī)學實驗，與之相關(guān)的操作包括細胞換液、傳代、凍存、復(fù)蘇、計數(shù)等，會涉及很多技術(shù)上的細節(jié)，尤其對于較為敏感的細胞，更應(yīng)注意每一步的操作。
小威特別結(jié)合日常實驗操作和國外文獻資料，收集一些關(guān)于細胞培養(yǎng)的常見問題和解答，方便細胞培養(yǎng)人員參考：
1、如果收到一管干冰運過來的細胞，能直接把它放到液氮中保存嗎？
答：在很多情況下，干冰（-80°C）運輸?shù)募毎梢苑呕匾旱笤龠M行快速解凍。然而，這樣處理后可能降低細胞活力。對于一些敏感的細胞系，這可能使細胞復(fù)蘇更加困難。這種現(xiàn)象被認為是由于溫度變化導致的細胞內(nèi)冰晶結(jié)構(gòu)的改變。因此，建議細胞在收到后應(yīng)盡快解凍和培養(yǎng)。減少在-80°C的儲存時間，這種溫度只用于運輸。
2、從液氮中取出細胞復(fù)蘇時，應(yīng)采取哪些安全措施？
答：在液氮中的細胞凍存管如果沒有*密封，有液氮漏入，解凍時凍存管的氣溫急劇上升，可能會導致爆炸。因此，當從液氮中取出細胞時，建議佩戴護目鏡和防護手套。復(fù)蘇時，應(yīng)將凍存管在37°C水浴中不斷搖動，在1-2分鐘內(nèi)使凍存液*融化。
之后用酒精棉球擦拭凍存管外壁，再拿入超凈臺內(nèi)，將細胞轉(zhuǎn)移到已加入10ml培養(yǎng)液的離心管內(nèi)，1000 rpm下離心5～10分鐘，棄去上清液，加入適量培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中，置 5% CO2孵箱靜置培養(yǎng)。
3、為什么應(yīng)將細胞儲存在液氮罐中的氣相而非液相？
答：細胞儲存在液氮氣相中更容易復(fù)蘇。而在液氮的液相中，如果凍存管沒有正確密封或有泄漏，細胞與液氮直接接觸，會使細胞解凍后活力受到影響。
4、對于懸浮細胞，如何更換培養(yǎng)基？
答：培養(yǎng)懸浮細胞可以只是簡單地添加新鮮培養(yǎng)基（如果空間允許）或者通過離心（100×g 5分鐘）從舊培養(yǎng)基中分離細胞，隨后將沉淀的細胞再懸浮于新鮮培養(yǎng)基中。
然而，對于大多數(shù)懸浮細胞系，簡單添加培養(yǎng)基是更好的方法。無論哪種方法，都需要細胞達到其zui大飽和密度之前更新培養(yǎng)基。細胞的飽和密度在3×10 5至2×10 6之間，具體依賴于細胞系和培養(yǎng)條件（靜置或攪動、氧合水平等）。
細胞必須稀釋至較低的細胞濃度以允許足夠的營養(yǎng)物質(zhì)恢復(fù)，使細胞保持對數(shù)生長。假如只是簡單地更換培養(yǎng)基而不降低細胞密度，細胞就會迅速耗竭培養(yǎng)基并死亡。
如果細胞被稀釋到其zui小密度之下，則會進入滯后期，生長非常緩慢，或者會死亡。每種懸浮細胞系的飽和密度和傳代間隔都不一樣，因此，每日細胞計數(shù)是監(jiān)測懸浮細胞系的方式。
5、細胞培養(yǎng)推薦的CO2水平是多少？
答：盡管細胞培養(yǎng)體系中的CO2水平范圍為0.03％~40%（通常大氣中的CO2約0.03％），但zui常見的在空氣中不添加CO2或者CO2濃度為5％~10％。
調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中*的濃度以與氣相中CO2水平達到平衡非常重要。細胞會產(chǎn)生CO2，同時需要少量的碳酸用于生長和存活。如果不添加CO2并且細胞大量繁殖，則可以使用4mM（0.34g / L）的無水*。
然而，這時培養(yǎng)瓶蓋子應(yīng)擰緊。如果培養(yǎng)體系需要5％或10％的CO2，則在37℃下分別使用23.5mM（1.97g / L）或47mM（3.95g / L）*，初始pH為約7.6。在這些條件下，應(yīng)使培養(yǎng)瓶松蓋或使用培養(yǎng)皿來保持氣體平衡。
6、為什么一些細胞需要丙酮酸鈉？我應(yīng)加多少丙酮酸鈉到培養(yǎng)基中？
答：丙酮酸鹽是糖酵解途徑中的*個容易進出細胞的有機酸代謝物。 因此，培養(yǎng)基中添加丙酮酸鈉能同時為合成代謝提供能量源和碳源，有助于維持某些特定的細胞，有助于細胞克隆或者在培養(yǎng)基中血清濃度降低時需要。丙酮酸鈉還有助于降低熒光引發(fā)的細胞毒性。通常加入的丙酮酸鈉終濃度為1mM。商品化的丙酮酸鈉溶液通常為100mM儲存液（100X）。
圖 糖酵解途徑
7、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿中的細胞密度是多少？
請參考如下數(shù)據(jù)：
細胞產(chǎn)量根據(jù)細胞密度1 x 106 cells/ cm2進行的估算。
細胞產(chǎn)量根據(jù)細胞密度1 x 105 cells/ cm2進行的估算。
多孔板中細胞的接種密度：
成像時密度通常為7500-20000個細胞/孔（96孔板）和1000-4000個細胞/孔（384孔板）。 細胞密度過高會導致自動對焦困難，特別是如果細胞長滿，并且擠在一起，通常會導致一些細胞位于焦點之外。細胞密度過低，導致許多空白區(qū)域和焦點損失，特別是在使用較高放大倍數(shù)時。接種密度可以通過在培養(yǎng)板上接種不同稀釋濃度的細胞，并使其在實驗條件下生長（可以促進或阻止生長）來評估。
圖 細胞密度較高時妨礙成像
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