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技術(shù)文章

大鼠白細胞介素1β(IL-1β)ELISA試劑盒操作方法:

閱讀:334發(fā)布時間:2017-3-20

本試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本大鼠白細胞介素1βIL-1β)的含量。

有效期:6個月

保存條件:2-8℃

本試劑盒僅供體外研究使用,不用于臨床診斷

 

 

 

實驗原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。往預先包大鼠白細胞介素1βIL-1β)捕獲抗體的包被微孔中,依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體,經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠白細胞介素1βIL-1β)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),計算樣品濃度。
樣本處理及要求

1.  血清將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4過一夜,然后1000×g離心20 分鐘,取上清即可,或?qū)⑸锨逯糜?20或-80保存,但應避免反復凍融。
2.  血漿用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本,并將標本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8 1000×g離心15分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20或-80保存,但應避免反復凍融。
3.  組織勻漿:用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果),稱重后將*碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS(一般按1:9的重量體積比,比如1g的組織樣品對應9mL的PBS,具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整,并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞,可以對勻漿液進行超聲破碎,或反復凍融。zui后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,取上清檢測。

4.  細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本:請1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。

注:標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,因此溶血標本不宜進行此項檢測。

 

需要而未提供的試劑和器材

  • 酶標儀(450nm)
  • 高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
  • 37℃恒溫箱
  • 蒸餾水或去離子水

 

試劑盒組成

名稱

96孔配置

48孔配置

備注

微孔酶標板

8孔×12

8孔×6

標準品

0.3mL*6管

0.3mL*6管

*

6mL

3mL

檢測抗體-HRP

10mL

5mL

20×洗滌緩沖液

25mL

15mL

按說明書進行稀釋

底物A

6mL

3mL

底物B

6mL

3mL

終止液

6mL

3mL

封板膜

2張

2張

說明書

1份

1份

自封袋

1個

1個

1.  標準品濃度依次為:40、20、10、5、2.5、0 pg/mL

2.  經(jīng)過大量正常標本檢驗,標本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi),實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可。當有部分樣本值超過zui大標準品濃度時,可用*將標本進行適當稀釋后再進行實驗。

 

注意事項

  • 嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
  • 洗板不正確可以導致不準確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。
  • 消除板底殘留的液體和手指印,否則影響OD值。
  • 底物顯色液應呈無色或很淺的顏色,已經(jīng)變藍的底物液不能使用。
  • 避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果。
  • 在儲存和溫育時避免強光直接照射。
  • 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
  • 任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。
  • 不能使用過期產(chǎn)品。
  • 如果可能傳播疾病,所有的樣品都應管理好,按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

 

試劑準備

試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡后方可使用。

20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

 

操作步驟

  1.   從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。
  2.   設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL;
  3.   樣本孔待測樣本50μL;空白孔不加。
  4.   除空白孔外,標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100μL,用封板膜封住反應孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
  5.   棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液(350μL,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復洗板5次(也可用洗板機洗板)。
  6.   每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
  7.   每孔加入終止液50μL,15min內(nèi),在450nm波長處測定各孔的OD值。

 

實驗結(jié)果計算

所測標準品的OD值為橫坐標,標準品的濃度值為縱坐標,在坐標紙上或用相關(guān)軟件繪制標準曲線,并得到直線回歸方程,將樣品的OD值代入方程,計算出樣品濃度。

 

試劑盒性能

  •  檢測范圍1.25 pg/mL  40 pg/mL
  •  靈敏度:zui低檢測濃度小于0.1 pg/mL。
  •  特異性:不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應。
  •  重復性:板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ,板間變異系數(shù)小于15% 。

 

說明

  • 由于現(xiàn)有條件及科學技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析,本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風險。
  • zui終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關(guān)操作以及當時的實驗環(huán)境密切相關(guān),請務必準備充足的標本備份。
  • 不同批次的同一產(chǎn)品可能會有少許差別,如:檢測限、靈敏度以及顯色時間等,請依據(jù)試劑盒內(nèi)說明書進行實驗操作,電子版說明書僅作參考。
  • 只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果,不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴格遵守本試劑盒的實驗說明才會得到的檢測結(jié)果。

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