硝基呋喃類藥物的危害及檢測目的

硝基呋喃類藥物常見的有呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林4種。硝基呋喃類藥物是一種廣譜抗生素，對一些革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、某些真菌和原蟲具有抑制和殺滅作用，且價(jià)格低廉，通常被用于預(yù)防和治療畜禽養(yǎng)殖業(yè)和水產(chǎn)業(yè)中因感染沙門氏菌和大腸埃希菌而產(chǎn)生的疾病。然而，硝基呋喃類藥物具有潛在的致畸、致癌、致突變作用，其濫用會造成動物體內(nèi)獸藥殘留，危害食用人群的身體健康。2020年我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號，也將硝基呋喃類藥物列入《食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》中。

本文闡述了如何將硝基呋喃類藥物代謝物從樣品基質(zhì)中分離提取出來，并經(jīng)過凈化后，轉(zhuǎn)化成液質(zhì)聯(lián)用儀可以檢測的形式。以酸解、衍生、提取、凈化為重點(diǎn)，依據(jù)國標(biāo)GB/T 21311-2007，為檢測人員和相關(guān)領(lǐng)域研究人員提供一定的參考。

檢測項(xiàng)目：硝基呋喃類藥物代謝物

應(yīng)用范圍：動物源性食品/肌肉/內(nèi)臟/魚/蝦/蛋/奶/蜂蜜/腸衣

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

方法原理：樣品經(jīng)鹽酸水解，鄰硝基苯（甲醛）過夜衍生，調(diào)pH值7.4后，用乙酸乙酯提取，正己烷凈化。分析物采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定性檢測，采用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量測定。

前處理儀器：組織搗碎機(jī)；分析天平（感量0.0001g和0.01g）；均質(zhì)器（10000 r/min）；振蕩器；恒溫箱；pH計(jì)（測量精度±0.02 pH單位）；離心機(jī)（10000 r/min）；氮吹儀；旋渦混合器；容量瓶（1 L，100 mL，10 mL）；具塞塑料離心管（50 mL）；刻度試管（10 mL）；移液槍（5 mL，1 mL,100 μL）。

檢測儀器：HPLC-MS/MS+ESI源

試樣制備

1.肌肉、內(nèi)臟、魚和蝦

從原始樣品取出有代表性樣品約500 g，用組織搗碎機(jī)充分搗碎混勻，均分成兩份，分別裝入潔凈容器作為試樣，密封，并標(biāo)明標(biāo)記。將試樣置于-18 ℃冷凍避光保存。

2.腸衣

從原始樣品取出有代表性樣品約100 g，用剪刀剪成邊長<5 mm的方塊，混勻后均分成兩份，分別裝入潔凈容器作為試樣，密封，并標(biāo)明標(biāo)記。將試樣置于-18 ℃冷凍避光保存。

3.蛋

從原始樣品取出有代表性樣品約500 g，去殼后用組織搗碎機(jī)攪拌充分混勻，均分成兩份，分別裝入潔凈容器作為試樣，密封，并標(biāo)明標(biāo)記。將試樣置于4 ℃冷藏避光保存。

4.奶和蜂蜜

從原始樣品取出有代表性樣品約500 g，用組織搗碎機(jī)充分混勻，均分成兩份，分別裝入潔凈容器作為試樣，密封，并標(biāo)明標(biāo)記。將試樣置于4 ℃冷藏避光保存。

前處理方法

1.水解和衍生化

肌肉、內(nèi)臟、魚、蝦和腸衣

稱取約2 g試樣（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入10 mL甲醇-水混合溶液（1+1，體積比），振蕩10 min后，以4000 r/min離心5 min，棄去液體。殘留物中加入10 mL 0.2 mol/L鹽酸，用均質(zhì)器以10000 r/min均質(zhì)1 min后，再依次加入混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，鄰硝基苯（甲醛）溶液100 μL，渦動混合30 s后，再振蕩30 min，置37 ℃恒溫箱中過夜（16 h）反應(yīng)。

蛋、奶和蜂蜜

稱取約2 g試樣（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入10 mL～20 mL 0.2 mol/L鹽酸（以樣品*浸潤為準(zhǔn)），用均質(zhì)器以10000 r/min均質(zhì)1 min后，再依次加入混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，鄰硝基苯（甲醛）溶液100 μL，渦動混合30 s后，再振蕩30 min，置37 ℃恒溫箱中過夜（16 h）反應(yīng)。

2.提取和凈化

取出樣品，冷卻至室溫，加入1 mL～2 mL 0.3 mol/L磷酸鉀（1 mL鹽酸溶液加0.1 mL磷酸鉀溶液），用2.0 mol/L氫氧化鈉調(diào)pH 7.4（±0.2）后，再加入10 mL～20 mL乙酸乙酯（乙酸乙酯加入體積與鹽酸溶液體積一致），振蕩提取10 min后，以10000 r/min離心10 min，收集乙酸乙酯層。殘留物用10 mL～20 mL乙酸乙酯再提取一次，合并乙酸乙酯層。收集液在40 ℃下用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?/span>1 mL 0.1%甲酸水溶液溶解，再用3 mL乙腈飽和的正己烷分兩次液液分配，去除脂肪。下層水相過0.20 μm微孔濾膜后，取10 μL供儀器測定。

3.混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

肌肉、內(nèi)臟、魚、蝦和腸衣

稱取5份約2 g的陰性試樣（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入10 mL甲醇-水混合溶液（1+1，體積比），振蕩10 min后，以4000 r/min離心5 min，棄去液體。殘留物中加入10 mL 0.2 mol/L鹽酸，用均質(zhì)器以10000 r/min均質(zhì)1 min后，按照定容濃度：1、5、10、50、100 ng/mL，分別加入混合中間標(biāo)準(zhǔn)溶液或混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，再加入混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，余下操作同肌肉、內(nèi)臟、魚、蝦和腸衣的衍生、提取和凈化步驟。

蛋、奶和蜂蜜

稱取5份約2 g的陰性試樣（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入10 mL～20 mL 0.2 mol/L鹽酸（以樣品*浸潤為準(zhǔn)），用均質(zhì)器以10000 r/min均質(zhì)1 min后，按照定容濃度：1、5、10、50、100 ng/mL，分別加入混合中間標(biāo)準(zhǔn)溶液或混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，再加入混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，余下操作同蛋、奶和蜂蜜的衍生、提取和凈化步驟。

國標(biāo)解讀及注意事項(xiàng)

1.由于硝基呋喃類藥物進(jìn)入動物體內(nèi)后，會快速轉(zhuǎn)化成為對應(yīng)的代謝物，且代謝物穩(wěn)定、殘留時(shí)間長、毒性更強(qiáng)，因此動物源性食品中都以檢測硝基呋喃類代謝物為主。動物飼料中才會檢測硝基呋喃類原藥。

2.由于硝基呋喃類代謝物見光容易分解，所以在樣品制備和前處理過程中盡量避光操作。

3.由于硝基呋喃類代謝物的分子質(zhì)量比較小，需要*行衍生化反應(yīng)，增加分子質(zhì)量，從而提高質(zhì)譜檢測靈敏度。

4.硝基呋喃類代謝物和蛋白質(zhì)結(jié)合緊密，需要酸解使其游離出來，同時(shí)進(jìn)行衍生化反應(yīng)。

5.特殊基質(zhì)蝦干、海米等，pH值比較高，在酸解過程中適當(dāng)提高鹽酸濃度，保證酸解效果；帶有裹粉類的食品，在生產(chǎn)和加工過程中會產(chǎn)生SEM，甲醇水洗滌后仍會有殘留，容易造成假陽性結(jié)果，在結(jié)果判定時(shí)需要注意這個(gè)問題。

6.由于硝基呋喃類代謝物檢測的特殊性，需要制作基質(zhì)加標(biāo)流程曲線進(jìn)行定量分析。在陰性試樣中，根據(jù)定容濃度加入相應(yīng)的外標(biāo)，其余操作同樣品前處理方法一致。

7.在建立液質(zhì)聯(lián)用檢測方法時(shí)，需要用到硝基呋喃類代謝物衍生后的四種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以及相對應(yīng)的四種同位素內(nèi)標(biāo)。

參考文獻(xiàn)

GB/T 21311-2007 動物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測方法 高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法

圖1 肌肉、內(nèi)臟、魚、蝦和腸衣中硝基呋喃類代謝物殘留量測定的前處理流程圖

圖2 蛋、奶和蜂蜜中硝基呋喃類代謝物殘留量測定的前處理流程圖

 表1  硝基呋喃類代謝物信息表