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標記抗體的原理：
目前較為常用的標記抗體的方法，FITC一般呈黃色、褐色或褐黃色粉末或結(jié)晶，性質(zhì)穩(wěn)定在低溫中能保存數(shù)年。在堿性條件下，FITC的碳酰胺鍵可與抗體蛋白上的賴氨酸氨基共價結(jié)合，形成FITC-蛋白質(zhì)結(jié)合物，即熒光抗體或熒光結(jié)合物。一個抗體分子上最多能標記15~20個FITC分子，被標記的抗體仍能保持與相應抗原結(jié)合的能力，在熒光燈源紫外線或藍紫光激發(fā)下產(chǎn)生黃綠色熒光，通過熒光顯微鏡進行觀察或利用流式細胞儀分析，從而對抗原進行定性、定位或定量。 

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抗體的種類：
抗體是在抗原刺激下產(chǎn)生的，體液性抗體由B淋巴細胞系產(chǎn)生。根據(jù)其化學結(jié)構(gòu)和抗原的不同可分為IgG、IgM、IgA、 IgE和IgD5種類型.目前對免疫球蛋白G、A、M、E了解較多，對D的功能了解較少。
（1） IgG：是血清中濃度的一類球蛋白，約占免疫球蛋白含量的70～80%，50%分布于血漿。機體受到抗原初次刺激后，其產(chǎn)生時間僅次于IgM。在抗體介導的抗感染免疫中起主要作用。IgG是球蛋白單體，分子量16萬～18萬，可以通過兔的胎盤，但不能通過豬和牛的胎盤。在體內(nèi)可以有效地抵抗細菌、病毒等微生物侵襲。在體外的血清學反應中，參與沉淀反應、凝集反應、補體結(jié)合反應和中和反應。
（2） IgM：由5個球蛋白單位組成的五聚體，在血清中的含量僅次于IgG，分子量90萬，是體內(nèi)的球蛋白?？乖醮未碳C體后，IgM出現(xiàn)最早,在血清中的含量僅次于IgG，主要分布在血管內(nèi)，可以通過激活補體發(fā)揮溶菌、溶細胞及中和病毒的作用。因其是五聚體，免疫作用很強，是IgG的100倍，但由于含量僅為IgG的1/10，且持續(xù)時間短，所以在抗感染免疫中不能起主要作用。在體外的血清學反應中，參與凝集反應和補體結(jié)合反應。
（3） IgA：有單體和雙體兩種形式。單體存在于血清中，分子量約為17萬，亦稱為血清型IgA，有抗菌和抗病毒作用。雙體主要存在于外分泌液中，如唾液、淚液、初乳、氣管分泌液，以初乳中的含量。雙體IgA亦稱為分泌型IgA，由存在于粘膜和組織上的漿細胞產(chǎn)生，分子量40萬，含量較單體高6～８倍，是粘膜的重要防御因素，可以阻止細菌或病毒吸附于粘膜表面。
（4） IgE：是一種特殊的糖蛋白，為單位體結(jié)構(gòu)，分子量19萬，由消化道、呼吸道粘膜固有層及局部淋巴結(jié)中的漿細胞所形成，在血清中含量甚微，是一種致敏抗體，容易吸附在細菌表面，當與相應抗原結(jié)合所引起過敏反應。在機體抵抗細菌和病毒的感染中幾乎無作用。多克隆抗體制備過程：
蛋白抗原
               ↘抗原準備→兔、小鼠免疫→抗血清→抗體純化  →鑒定（ELISA、WB、IHC）
多肽偶聯(lián)  ↗                                                 （抗原親和純化）
從細胞中提取出來的生物大分子是不純凈的，必須進一步分離純化才能獲得純品。在生物大分子制備工作中，分離純化是比較復雜和重要的一個環(huán)節(jié)。對于異類的物質(zhì)，如提純蛋白質(zhì)和酶時混雜著核酸，提純核酸時混雜著蛋白質(zhì)或多糖，一般可用專一性酶水解、有機溶劑抽提、選擇性分部沉淀等方法處理，小分子物質(zhì)常在整個制備過程中多次液相與固相互相轉(zhuǎn)化被分離或用透析方法除去。而對同類物質(zhì)，如酶和雜蛋白，RNA和DNA以及不同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)、酶、核酸之間的分離，情況則復雜得多，主要應用的方法有電泳法、超速離心法、鹽析法、有機溶劑沉淀法、吸附法、結(jié)晶法、電點沉淀法、柱層析法
抗原抗體反應影響因素：
（一）反應物自身的因素
5） 抗體：不同來源的抗體,反應性各有差異,抗體的濃度、特異性和親和力都影響抗體抗原反應,為提高試驗的可靠性,應選擇高特異性、高親和力的抗體作診斷試劑.等價帶的寬窄也影響抗原抗體復合物的形成,單克隆抗體不適用于沉淀反應.
6）  抗原：抗原的理化性狀、分子量、抗原決定簇的種類及數(shù)目均可影響反應結(jié)果.顆粒性抗原出現(xiàn)凝集反應,可溶性抗原出現(xiàn)沉淀反應,單價抗原與相應抗體結(jié)合不出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象.
（二）反應環(huán)境條件
7） 酸堿度：抗原抗體反應必須在合適的pH環(huán)境中進行.蛋白質(zhì)具有兩性電離性質(zhì),因此每種蛋白質(zhì)都有固定的等電點.抗原抗體反應一般在pH6～9進行,有補體參與的反應pH為7.7.4,pH過高或過低都將影響抗原與抗體反應.
8）  溫度：在一定范圍內(nèi),溫度升高可加速分子運動,抗原與抗體碰撞機會增多,使反應加速.一般為15℃～40℃,常用的抗原抗體反應溫度為37℃,溫度如高于56℃,可導致已結(jié)合的抗原抗體再解離,甚至變性或破壞.每種試驗都有其*的最適反應溫度要求.此外,適當振蕩也可促進抗原抗體分子的接觸,加速反應.
9）  電解質(zhì)：抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合后,雖由親水膠體變?yōu)槭杷z體,若溶液中無電解質(zhì)參加,仍不出現(xiàn)可見反應.為了促成沉淀物或凝集物的形成,常用0.85%NaCl或各種緩沖液作為抗原及抗體的稀釋液

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