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更新時(shí)間：2018-06-19 15:07:48瀏覽次數(shù)：244次
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基因結(jié)構(gòu)和功能研究產(chǎn)品基因的定點(diǎn)突變是重要的分子生物學(xué)技術(shù)，廣泛用于載體構(gòu)建、基因改造、蛋白質(zhì)功能研究等領(lǐng)域。但傳統(tǒng)的方法需要使用單鏈DNA模板，而得到單鏈DNA模板又需要先將基因克隆到類似M13這種載體中，操作過程冗長(zhǎng)。為了克服這些缺點(diǎn)，本公司將突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)到一對(duì)互補(bǔ)的引物中，用高保真DNA聚合酶擴(kuò)增質(zhì)粒模板，然后用Dpn I去除原始的甲基化模板，新合成的DNA通過互補(bǔ)形成帶切口的雙鏈質(zhì)粒，直接
基因結(jié)構(gòu)和功能研究產(chǎn)品
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基因結(jié)構(gòu)和功能研究產(chǎn)品 | 10次 | 詢價(jià) |
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基因的定點(diǎn)突變是重要的分子生物學(xué)技術(shù)，廣泛用于載體構(gòu)建、基因改造、蛋白質(zhì)功能研究等領(lǐng)域。但傳統(tǒng)的方法需要使用單鏈DNA模板，而得到單鏈DNA模板又需要先將基因克隆到類似M13這種載體中，操作過程冗長(zhǎng)。為了克服這些缺點(diǎn)，本公司將突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)到一對(duì)互補(bǔ)的引物中，用高保真DNA聚合酶擴(kuò)增質(zhì)粒模板，然后用Dpn I去除原始的甲基化模板，新合成的DNA通過互補(bǔ)形成帶切口的雙鏈質(zhì)粒，直接用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌。本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn)：
1. 直接使用質(zhì)粒DNA作為模板，免去了制備單鏈DNA的步驟。
2. 基于高保真PCR，對(duì)模板DNA序列沒特殊要求，可以用于突變?nèi)魏涡蛄?。同時(shí)對(duì)模板的需求量很少。
3. 一管式，全部在一個(gè)優(yōu)化的緩沖體系中完成，非常簡(jiǎn)單。
4. 使用Dpn I去除未突變模板，突變效率高達(dá)90%。
5. 不需要連接步驟，反應(yīng)結(jié)束后可以直接轉(zhuǎn)化。
6. 提供陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pUC19和突變引物，便于分析失敗原因。
7. 可用于制備點(diǎn)突變，缺失突變和插入突變。
8. 使用于從dam+細(xì)菌中純化的質(zhì)粒（常用的宿主菌都是dam+），由于JM110和SCS110為dam-，所以從中提取的質(zhì)粒不能用本產(chǎn)品制備突變。
RNA提取法：試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯時(shí)，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層(無色)主要為RNA，有機(jī)層(黃色)主要為DNA和蛋白質(zhì)。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1、RNA的提取;
2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;
3、PCR擴(kuò)增;
4、產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測(cè)定。
RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在zui條件下進(jìn)行。
堿變性提取質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)*分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。
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