按雜質(zhì)譜控制的理念, 在藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中, 要求所采用的分析方法不僅能分離出樣品中實(shí)際存在的雜質(zhì), 且能分離出各類潛在的雜質(zhì), 并對(duì)分離出的主要雜質(zhì)能進(jìn)行定性, 以便根據(jù)其來(lái)源和生理活性制定不同的質(zhì)控限度. 縱觀各國(guó)藥典的發(fā)展, 利用反相HPLC 系統(tǒng)分析有關(guān)物質(zhì)已成為藥品質(zhì)量控制的主流.河源市藥物結(jié)構(gòu)確認(rèn)及雜質(zhì)分析-CMA資質(zhì)

詳細(xì)介紹

河源市藥物結(jié)構(gòu)確認(rèn)及雜質(zhì)分析-CMA資質(zhì)

NMR（核磁共振）測(cè)試

儀器：德國(guó) Bruker DRX- 400 ，400MHz超導(dǎo)脈沖付里葉變換核磁共振譜儀；

測(cè)試條件：溶劑： CDCl₃

參考物： TMS

溫度： 20ºC

頻率： ¹H譜：400.130MHz；¹³C譜：100.613MHz

測(cè)試結(jié)果：樟腦樣品（批號(hào)為：Yz1408019）經(jīng)核磁共振氫（¹H）譜、碳（¹³C）譜、DEPT（DEPT135和DEPT90）譜、¹H-¹H COSY譜、¹³C-¹H COSY譜、HMBC譜分析，確認(rèn)該樣品與樟腦（即1,7,7-*基二環(huán)[2,2,1]庚烷-2-酮）的化學(xué)結(jié)構(gòu)（見(jiàn)結(jié)構(gòu)圖）相符。

5. MRM 技術(shù)在定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用復(fù)雜組分共流出物的干擾和寬達(dá)9 個(gè)數(shù)量級(jí)以上的動(dòng)態(tài)范圍，一直是影響血清或血漿等生物體液中蛋白質(zhì)、多肽準(zhǔn)確定量的關(guān)鍵因素。盡管研究者們也嘗試采用多種方法，包括盡可能充分的色譜分離，去除高豐度蛋白質(zhì)等，但質(zhì)譜對(duì)低豐度蛋白質(zhì)

的檢測(cè)靈敏度和精密度仍不能滿足分析的要求。M R M 技術(shù)在定量蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用上展現(xiàn)了其方法

的優(yōu)點(diǎn)。首先，在一定程度上提高了測(cè)定的動(dòng)態(tài)范圍，其原因一方面是因?yàn)閷?duì)離子的選擇檢出，降低了復(fù)雜組分的背景信號(hào)，增強(qiáng)了一些低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)靈敏度；另一方面通過(guò)對(duì)高豐度、低豐度蛋白質(zhì)M R M 離子對(duì)的選擇來(lái)均衡兩者的響應(yīng)信號(hào)差異。例如，對(duì)高豐度蛋白質(zhì)，選擇響應(yīng)豐度較低的母離子- 子離子對(duì)；對(duì)低豐度蛋白質(zhì)，選擇響應(yīng)程度較高的母離子- 子離子對(duì)，從而均衡高、低豐度的信號(hào)差異。其次，減少了復(fù)雜組分共流出物的干擾，增強(qiáng)了檢測(cè)的特異性。此外，MRM 技術(shù)高通量的特點(diǎn)，也為多種蛋白質(zhì)的同時(shí)定量提供了條件。M R M 技術(shù)通過(guò)與同位素稀釋法或m T R A Q 技術(shù)結(jié)合，對(duì)已知量加入的內(nèi)標(biāo)肽段和樣本中的真實(shí)肽段分別進(jìn)行標(biāo)記，選擇不同母- 子離子對(duì)獲得不同的色譜檢出信號(hào)，比較兩者信號(hào)，從而產(chǎn)生定量結(jié)果[12,13]。

Anderson 等[14]用MRM 技術(shù)定量分析了人體血漿中53 種高、中豐度蛋白質(zhì)。其中47 個(gè)數(shù)據(jù)同批變異系數(shù)為2%～22%，顯示了定量的良好精密度。分析結(jié)果的動(dòng)態(tài)范圍達(dá)到4.5 個(gè)數(shù)量級(jí)。Lin 等[15]用M R M 定量測(cè)定了人體血漿中中等豐度蛋白質(zhì)的實(shí)際濃度。測(cè)定結(jié)果表明其濃度范圍達(dá)到了3～700 nmol/L。12 次反復(fù)測(cè)量變異系數(shù)(CV)值小于25%。對(duì)于血漿中的低豐度蛋白質(zhì)，Keshishian 等[16]也采用MRM 和同位素稀釋的方法進(jìn)行了定量分析。在未進(jìn)行蛋白質(zhì)或多肽親和富集的條件下，去除血漿6 種高豐度蛋白質(zhì)后，低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)限在1～10 mg/L，CV值在3%～15%，與質(zhì)譜直接檢測(cè)血漿蛋白的方法相比，分析性能改善了1000 倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了這種MRM 技術(shù)進(jìn)行定量的高精密度，以及用于分析復(fù)雜樣本的高動(dòng)態(tài)范圍。

6. MRM 技術(shù)在蛋白質(zhì)與RNA 相互作用研究中的應(yīng)用蛋白質(zhì)- R N A 復(fù)合物在調(diào)控真核細(xì)胞的基因表達(dá)上具有重要意義?；贛 S 的方法研究蛋白質(zhì)與R N A 的相互作用多有報(bào)道，而采用M R M 與其他技術(shù)相結(jié)合的方法，能更深入地研究蛋白質(zhì)與RNA 作用的結(jié)構(gòu)域，得到更豐富的相互作用結(jié)構(gòu)信息。其原理是：通過(guò)母離子掃描的模式，獲得含有磷酸碎片的所有多肽離子的準(zhǔn)確分子量和電荷數(shù)。設(shè)計(jì)MRM 離子對(duì)，母離子掃描獲得的信號(hào)離子作為母離子，子離子設(shè)定為堿基序列AUGC ，在MRM 的檢測(cè)域值達(dá)到設(shè)定值后，進(jìn)行高分辨增強(qiáng)子離子掃描, 終獲取蛋白質(zhì)序列信息和與其作用的R N A 序列信息。Lenz 等[17]采用此方法，研究了U1SnRNP 和1515K-61K-U4atacSnRN 與RNA 的相互作用信息，分別用*和R N A 酶T 1、A 對(duì)蛋白質(zhì)和R N A 進(jìn)行酶切，得到相互作用的短肽段和RNA 的短序列，在負(fù)離子模式進(jìn)行母離子掃描，依據(jù)獲得的結(jié)果設(shè)計(jì)MRM 母- 子離子對(duì)，在正離子模式進(jìn)行MRM-子離子增強(qiáng)掃描，后得到了相互作用結(jié)構(gòu)域等更為詳細(xì)的信息。

7. 展望M R M 技術(shù)是基于蛋白質(zhì)或多肽的已知信息或假定信息進(jìn)行質(zhì)譜信號(hào)采集，有針對(duì)性地獲取數(shù)據(jù)的方式。通過(guò)與其他質(zhì)譜掃描技術(shù)的聯(lián)合使用，能在蛋白質(zhì)組研究中充分展現(xiàn)其高靈敏度、高準(zhǔn)確性、高重復(fù)性、高通量的應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)。可以預(yù)見(jiàn)，通過(guò)對(duì)M R M 技術(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化，例如優(yōu)化M R M 母－子離子的選擇條件，從已有的蛋白質(zhì)譜中人工獲取或利用軟件計(jì)算母- 子離子；優(yōu)化每次運(yùn)行MRM 離子對(duì)的數(shù)目，改善色譜峰形，或者通過(guò)設(shè)立不同時(shí)間段檢測(cè)離子對(duì)，增加分析通量；聯(lián)合其他多種質(zhì)譜掃描技術(shù)，將使M R M 技術(shù)擁有更好的應(yīng)用前景，更有效地滿足蛋白質(zhì)組學(xué)的分析需求。

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