大腸桿菌抗體（E-coli Ab）ELISA檢測試劑盒
檢測原理
試劑盒采用間接法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被雞大腸桿菌抗體（E-coli Ab）捕獲抗原的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。

詳細(xì)介紹

大腸桿菌抗體（E-coli Ab）ELISA檢測試劑盒

樣品收集、處理及保存方法

1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3. 細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

酶標(biāo)儀（450nm）
高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
37℃恒溫箱

操作注意事項

試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正常現(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。
實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。
預(yù)處理后的樣本無需稀釋，直接取10μL加樣即可。
嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。
所有液體組分使用前充分搖勻。

試劑盒組成

名稱	96孔配置	48孔配置	備注
微孔酶標(biāo)板	96孔	48孔	無
陰性對照	0.3mL	0.3mL	無
陽性對照	0.3mL	0.3mL	無
*	6mL	3mL	無
檢測抗體-HRP	10mL	5mL	無
20×洗滌緩沖液	25mL	15mL	按說明書進(jìn)行稀釋
底物A	6mL	3mL	無
底物B	6mL	3mL	無
終止液	6mL	3mL	無
封板膜	2張	2張	無
說明書	1份	1份	無
自封袋	1個	1個	無

試劑的準(zhǔn)備

20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

洗板方法

手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。
自動洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步驟

從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
設(shè)置陰、陽性對照孔和樣本孔，陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照各50μL；
待測樣本孔先加待測樣本10μL，再加*40μL；
隨后陰、陽性對照孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。
每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

結(jié)果判斷

1. 試驗有效性：陽性對照孔OD值平均值≥1.00；

陰性對照孔OD值平均值≤0.15。

2. 臨界值（Cut off）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15

3. 陰性判斷：樣品OD值＜臨界值（Cut off），樣品為陰性

4. 陽性判斷：樣品OD值＞臨界值（Cut off），樣品為陽性

試劑盒性能