核因子κB受體活化因子配基（RANKL）ELISA檢測(cè)試劑盒
檢測(cè)原理
試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被人核因子κB受體活化因子配基（RANKL）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。

詳細(xì)介紹

核因子κB受體活化因子配基（RANKL）ELISA檢測(cè)試劑盒

樣品收集、處理及保存方法

1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3. 細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

酶標(biāo)儀（450nm）
高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
37℃恒溫箱

操作注意事項(xiàng)

試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。
實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。
預(yù)處理后的樣本無(wú)需稀釋，直接取10μL加樣即可。
嚴(yán)格按照說(shuō)明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。
所有液體組分使用前充分搖勻。

試劑盒組成

名稱	96孔配置	48孔配置	備注
微孔酶標(biāo)板	12孔×8條	12孔×4條	無(wú)
標(biāo)準(zhǔn)品	0.3mL	0.3mL	無(wú)
*	6mL	3mL	無(wú)
檢測(cè)抗體-HRP	10mL	5mL	無(wú)
20×洗滌緩沖液	25mL	15mL	按說(shuō)明書進(jìn)行稀釋
底物A	6mL	3mL	無(wú)
底物B	6mL	3mL	無(wú)
終止液	6mL	3mL	無(wú)
封板膜	2張	2張	無(wú)
說(shuō)明書	1份	1份	無(wú)
自封袋	1個(gè)	1個(gè)	無(wú)

注：標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：800、400、200、100、50、0 pg/mL.

試劑的準(zhǔn)備

20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

洗板方法

手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。
自動(dòng)洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步驟

從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；
待測(cè)樣本孔先加待測(cè)樣本10μL，再加*40μL；
隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。
每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。