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土壤酸性蛋白酶(S-ACPT)試劑盒,微板法

土壤酸性蛋白酶(S-ACPT)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 土壤酸性蛋白酶（Solid -Acid Protease，S-ACPT）試劑盒說明書 （貨號：WS6130W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 蛋白酶是廣泛存在于土壤中的一大酶類，它能水解各種蛋白質(zhì)以及肽類等化合物為氨基酸，因此土壤蛋 白酶的活性與土壤中氮素的轉(zhuǎn)化狀況有極其重要的關(guān)系。 土壤酸性蛋白酶（S-ACPT）在酸性條件下將酪蛋白水解產(chǎn)生酪*酸；酪*酸與福林酚在堿性條件下反應(yīng) 生成藍(lán)色化合物；該藍(lán)色物質(zhì)在 680nm 有特征吸收峰，進(jìn)而得 S-NPT 酶活，由于底物酪蛋白自身含有多種 氨基酸，所以在檢測過程中必須設(shè)置帶有底物酪蛋白的對照，以扣除有干擾的背景值，排除假陽性。 二、測試盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格試劑名稱 保存要求 備注 試劑一 液體 120mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑 mg×2 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，每瓶加入 3mL 試 劑 三 90℃ 加 熱 攪 拌 至 分 散 （ 約 10-20min），再加 12mL 試劑一攪拌至溶解， 最后再加試劑一定容至 30mL,繼續(xù)攪拌至 全部溶解（約 30min）；配置完的試劑 4℃保 存，三天內(nèi)用完。 試劑三 液體 10mL×1 瓶 4℃保存 用前搖勻 試劑四 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 用前搖勻 試劑五 液體 35mL×1 瓶 4℃保存 用前搖勻 試劑六 液體 8mL×1 棕色瓶 4℃保存 現(xiàn)用現(xiàn)配，臨用前加 16mL 蒸餾水， 4℃保存，一星期內(nèi)用完 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 EP 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 【注】:試劑二若在磁力攪拌器（帶溫控）上溶解，可用錫箔紙或保鮮膜蓋住燒杯，以免溶解過程中水分 蒸發(fā)過快。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、水浴鍋、磁力攪拌器、可調(diào)式移液槍、蒸餾水 四、土壤酸性蛋白酶（S-ACPT）活性測定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： 取新鮮土樣或者 37 度烘箱風(fēng)干（需先粗研磨），過 40 目篩網(wǎng)備用。 2、上機(jī)檢測： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 680nm。 ② 配制好的試劑二需預(yù)先 50℃水浴 10min。 ③ 在 EP 管中依次加入下列試劑培養(yǎng)： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 土樣（g） 0.15g 鮮土 或 0.1g 干土 0.15g 鮮土 或 0.1g 干土 試劑一 500 500 試劑二 500 50℃振蕩培養(yǎng) 2h，同時(shí)，余下的試劑二須單獨(dú) 50℃振蕩培養(yǎng) 2h 上歩單獨(dú) 50℃培養(yǎng)過的試劑二 500本試劑盒僅供科研使用 2 試劑四 500 500 混勻，立即 1700rpm（須準(zhǔn)確），4℃離心 10min，上清液待用 ④ 顯色反應(yīng)：在 EP 管中依次加入： 上清液 200 200 試劑五 300 300 試劑六 200 200 室溫靜置 20min（若仍渾濁，可以延長靜置時(shí)間至 30min 或 1700rpm 離心 10min），取 200μL 于 96 孔板中，于 680nm 讀取吸光值 A， △A=A 測定管-A 對照管（每個(gè)樣本做一個(gè)對照管）。 【注】：若△A 的值在零附近徘徊，可以加樣土樣取樣量（如兩倍的土壤質(zhì)量）。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)曲線準(zhǔn)方程：y = 0.0154x + 0.0015，x 是標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL），y 是ΔA。 2、單位定義：每小時(shí)每克鮮土中產(chǎn)生 1μg 酪*酸為一個(gè)酶活力單位。 土壤酸性蛋白酶(S-ACPT)(μg/h/g 鮮土)=(ΔA-0.0015)÷0.0154×V1÷W1÷T =48.8×(ΔA-0.0015) ÷W1 3、單位定義：每小時(shí)每克干土中產(chǎn)生 1μg 酪*酸為一個(gè)酶活力單位。 同等質(zhì)量的鮮土（參與實(shí)際反應(yīng)的鮮土質(zhì)量）在 105℃烘干，即得相應(yīng)的干土質(zhì)量。 土壤酸性蛋白酶(S-ACPT)(μg/h/g 干土)= (ΔA-0.0015)÷0.0154×V1÷W2÷T =48.8×(ΔA-0.0015) ÷W2 V1---培養(yǎng)步驟中總的反應(yīng)體積，1500μL =1.5mL； T---反應(yīng)時(shí)間，2h； W1---樣本質(zhì)量，以實(shí)際稱取鮮土質(zhì)量為準(zhǔn)； W2---相對應(yīng)的干土質(zhì)量。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（100μg/mL）：標(biāo)準(zhǔn)品溶解于 100mL 的 0.1mol/L 的鹽酸溶液中（母 液需在兩天內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 4, 8, 12, 16, 20. μg/mL。也可根據(jù)實(shí)際樣本 來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)測定管的顯色反應(yīng)階段加樣表依次加樣，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。