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多糖含量測(cè)定試劑盒（ben酚-硫酸）微板法

多糖含量測(cè)定試劑盒（ben酚-硫酸）微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 多糖含量試劑盒說(shuō)明書 (貨號(hào)：WS3950F 分光法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 糖在濃硫酸作用下，水解生成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與*酚縮合成橙 黃色化合物，且顏色穩(wěn)定，在波長(zhǎng) 488 nm 處和一定的濃度范圍內(nèi)，其吸光度與多糖含量 呈線性關(guān)系正比，從而可以利用分光度計(jì)測(cè)定其吸光度，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量測(cè)定樣品的 多糖含量，本方法可用于多糖含量的測(cè)定 二、試劑盒組分與配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 試劑一 粉劑×3 支 4℃保存 臨用前甩幾下使試劑落入底部， 每支分別加 1.9mL 水溶解備用。 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 可見(jiàn)分光光度計(jì)、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、水浴鍋/金屬浴、可調(diào)式移液器、乙 醇、濃硫酸（不允許快遞）、研缽。 四、多糖含量的測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1 多糖待檢液制備： a.組織樣本： ① 樣本烘干研磨過(guò) 40 目篩，稱取 3mg 過(guò)篩后細(xì)末至 2mLEP 管中，加入 2mL 蒸餾水， 于沸水浴（95-100℃）加熱 2 小時(shí)（若放在金屬浴上面可用重物壓蓋防止 EP 管崩 開(kāi)；間隔 20min 帶防護(hù)手套輕輕晃動(dòng)混勻幾下），加熱結(jié)束后取出放置至室溫， 8000rpm 離心 5min， ② 取 0.2mL 上步離心后的上清液至新 EP 管中，再加入 1mL 乙醇混勻，于 4℃放置 1 小時(shí)，取出后 8000rpm 離心 5min 后棄上清，留沉淀； ③ 上步所得沉淀中再加入 1mL80%乙醇混勻幾下（自備：取 80mL 乙醇溶于 20mL 蒸 餾水中），8000rpm 離心 5min 后棄上清，留沉淀（可采用使 EP 管輕輕倒置于吸 水紙上約 5min 吸干剩余上清液，盡量避免沉淀?yè)p失）； ④ 向上步所得沉淀中加入 2mL 蒸餾水，于沸水?。?/span>95-100℃）加熱直到沉淀全部溶 解（約 5min）即多糖待檢液。 b.液體樣本： ① 取 0.2mL 液體(可先做兩個(gè)樣本預(yù)測(cè)定，確定適合本批液體樣本取樣量 V2)，至新 EP 管中，再加入 1mL 乙醇混勻（使乙醇在整個(gè)液體中占比至少 80%），于 4℃放 置 1 小時(shí)，取出后 8000rpm 離心 5min 后棄上清，留沉淀； ②上步所得沉淀中再加入 1mL80%乙醇混勻幾下（自備：取 80mL 乙醇溶于 20mL 蒸 餾水中），8000rpm 離心 5min 后棄上清，留沉淀（可采用使 EP 管輕輕倒置于吸 水紙上約 5min 吸干剩余上清液，盡量避免沉淀?yè)p失）； ③ 向上步所得沉淀中加入 2mL 蒸餾水，于沸水?。?/span>95-100℃）加熱直到沉淀全部溶 解（約 5min）即多糖待檢液。 2、上機(jī)檢測(cè)：本試劑盒僅供科研使用 2 ① 可見(jiàn)分光光度計(jì)預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 488nm，調(diào)節(jié)水浴鍋或金屬浴至 95-100℃。 ② 向標(biāo)準(zhǔn)品中加入 1mL 蒸餾水即 1mg/mL 葡萄糖母液，用蒸餾水稀釋 20 倍（1 份母液:19 份水）成 0.05mg/mL 葡萄糖，用于測(cè)定。在 EP 管中依次加入： 試劑（μL） 測(cè)定管 空白管（僅做一次） 多糖待檢液 200 標(biāo)準(zhǔn)品 蒸餾水 200 試劑一 100 100 濃硫酸(務(wù)必緩慢加入) 500 500 混勻放入 95℃水浴 20min（封口膜纏緊，防止水分散失），冷 卻至室溫后，取全部澄清液體轉(zhuǎn)移至 1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）中，于 488nm 讀取吸光值 A，ΔA=A 測(cè)定管-A 空白管。 【注】:1. 如果ΔA 大于 1.5，需要將樣本用蒸餾水稀釋，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù) D。 2. 若ΔA 值在零附近即低于 0.005，則可增加樣本取樣質(zhì)量 W，則改變后的 W 需代 入公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)方程為 y = 56.157x - 0.0036；x 為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（mg），y 為吸光值ΔA。 2、按樣本重量計(jì)算： 多糖(mg /g 重量)=[(ΔA+0.0036)÷56.157]÷(W×V1÷V)×10×D =1.781×(ΔA+0.0036)÷W×D 3、按質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）計(jì)算： 多糖(%重量)=[(ΔA+0.0036)÷56.157]÷(W×V1÷V)×10×D×10-3×100% =[0.1781×(ΔA+0.0036)÷W×D]% 4、按液體體積計(jì)算： 多糖(mg /mL 液體)=[(ΔA-0.0065)÷86.454]÷(V2×V1÷V)×10×D =2.313×(ΔA-0.0065)÷V2×D V---樣品提取液總體積，2mL； V1---測(cè)定時(shí)待檢液體積，0.2mL； V2---液體取樣體積，mL； 10---②歩中取 0.2mL 處理后變成 2mL 體積； W---樣本質(zhì)量，g； D---自行稀釋倍數(shù)，未稀釋即為 1W---樣本質(zhì)量，g； 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過(guò)程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（1mg/mL）：從標(biāo)準(zhǔn)品管中稱量取出 2mg 至一新 EP 管中，再加 2mL 蒸餾水混勻溶解即 1mg/mL 的葡萄糖（母液需在兩天內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液用蒸餾水稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05. mg/mL。也可根據(jù)實(shí)際樣本來(lái)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)測(cè)定管的加樣表操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

多糖含量測(cè)定試劑盒（ben酚-硫酸法）微板法