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肌酸激酶(CK)試劑盒(定磷法),微板法

肌酸激酶(CK)試劑盒(定磷法),微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 肌酸激酶（Creatine Kinase, CK）活性測定說明書 （貨號：WS2880W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 肌酸激酶（CK，EC 2.7.3.2）主要存在于心臟、肌肉及腦等組織中，能可逆地催化 肌酸與 ATP 之間的轉(zhuǎn)磷?；磻?yīng)，在能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮和 ATP 再生中有重要作用。 肌酸激酶（CK）催化三磷酸腺苷和肌酸生成磷酸肌酸，后者很快全部水解為磷酸， 但是三磷酸腺苷和生成的二磷酸腺苷仍很穩(wěn)定；通過定磷試劑來測定磷酸肌酸水解出 的磷酸含量檢測 CK 酶活性大小。 二、試劑盒的組成和配制： 【注】：全程操作需無磷環(huán)境；試劑配置用新槍頭和玻璃移液器等，避免磷污染。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、肌酸激酶（CK）活性檢測： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。 4℃×12000rpm 離 心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取。 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：直接檢測；若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機(jī)檢測： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 700nm，所有試劑解凍至室溫（25℃）。 ② 試劑一和二和三可按照 20:20:210 預(yù)先配成混合液（現(xiàn)配現(xiàn)用）；在 EP 管中依次加入： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 提取液 120mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉體 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部，再加 4.2mL 蒸餾水溶解（可超聲溶解）。 試劑二 粉體 mg×1 支 -20℃保 存 用前甩幾下使試劑落入底部，再加 4.2mL 蒸餾水溶解（可超聲溶解）。 試劑三 液體 44mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 液體 9mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 A:粉體 mg×2 瓶 B:液體 6.5mL×1 瓶 4℃保存 臨用前在一瓶試劑 A 中加 3.24mL 的 B 液，再加41.76mL蒸餾水混勻溶解備用。 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 試劑一 20 20 試劑二 20 20本試劑盒僅供科研使用 2 ③ 顯色反應(yīng)，在 EP 管中直接加入： 【注】1.若△A 低于 0.01 可增加②歩中樣本加樣體積 V1(如增至 100μL，則試劑三 相應(yīng)減少，總反應(yīng)體系不變)，或延長 37℃ 孵育時間 T（如增至 60min）； 或增加取樣質(zhì)量 W；則改變后的 V1 和 T 和 W 需代入公式計算。 2.若 A 大于 1.2，可用蒸餾水對③歩中上清液稀釋，則稀釋倍數(shù) D 代入公式計算。 五、結(jié)果計算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y = 0.4836x - 0.0025，x 是標(biāo)準(zhǔn)品摩爾濃度（μmol/mL）, y 是△A。 2、按蛋白濃度計算： 定義：每小時每毫克組織蛋白產(chǎn)生 1μmol 磷酸肌酸的量為一個酶活力單位。 酶活力(μmol/h/mg prot)=[(△A+0.0025)÷0.4836×V2] ÷(V1×Cpr)÷T=28.12×(△A+0.0025)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 定義：每小時每克組織產(chǎn)生 1μmol 磷酸肌酸的量為一個酶活力單位。 酶活力(μmol/h/g 鮮重)=[(△A+0.0025)÷0.4836×V2]÷(W×V1÷V)÷T=28.12×(△A+0.0025)÷W 4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算： 定義：每小時每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞產(chǎn)生 1μmol 磷酸肌酸的量為一個酶活力單位。 酶活力(μmol/h /104 cell)=[(△A+0.0025)÷0.4836×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.056×(△A+0.0025) 5、按液體體積計算： 定義：每小時每毫升液體產(chǎn)生 1μmol 磷酸肌酸的量為一個酶活力單位。 酶活力(μmol/h/mL)=[(△A+0.0025)÷0.4836×V2]÷V1÷T=28.12×(△A+0.0025) V---加入提取液體積，1mL； V1---加入樣本體積，0.05mL ； W---樣本鮮重，g； V2---酶促反應(yīng)總體積，0.34mL； T---反應(yīng)時間，1/2 小時； 500---細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（20μmol/mL）：標(biāo)準(zhǔn)品用 1mL 蒸餾水溶解。（母液需在兩天內(nèi)用）。 2 把母液用蒸餾水稀釋成六個濃度標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2. μmol/mL。也可根據(jù)實(shí)際樣本來調(diào) 整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)③歩中顯色反應(yīng)階段測定管的加樣體系操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 試劑三 210 210 樣本 50 37℃ 孵育 30min 試劑四 40 40 樣本 50 混勻，8000rpm，4℃離心 5min，上清液待測。 上清液 100 100 試劑五 400 400 混勻，室溫靜置 10min，若渾濁則可 8000rpm，4℃ 或室溫離心 5min，取 250μL 澄清液體至 96 孔板中， 于 700nm 下讀取各管吸光值，△A=A 測定-A 對照（每 個樣本做一個自身對照）。