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上海雅吉生物科技有限公司
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更新時間：2019-06-19 08:29:37瀏覽次數(shù)：92
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人支原體染料法熒光定量PCR試劑盒自誕生以來，人們就在努力探索PCR定量的方法。熒光素染色凝膠電泳在PCR初的一段時間是的檢測技術，因此人們在凝膠電泳的基礎上使用掃描照片進行光密度分析，以求實現(xiàn)PCR的相對定量。
但是由于普通凝膠電泳檢測本身的不特異性，只能進行粗略的相對定量，難以滿足人們日益對精確定量的渴望，不過由于普通凝膠電泳光密度分析簡捷易行，成本低，目前還是科研還很常用。但是難以滿足臨床應用的要求。
由于固相捕獲技術的成熟和應用，特別是酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）的成功，給核酸定量提供了一個思路。此后，應用固相捕獲的PCR定量技術應運而生。即在PCR擴增以后，在微也板上借用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）的原理，使用酶標抗體，進行固相雜交來實現(xiàn)定量。被稱為PCR－ELISA ：
PCR－ELISA原理：
首先，使用親和素包被微孔板，再用生物素標記捕獲探針3`端（捕獲探針5`端和待檢靶序列5`端的一段互補）通過生物素和親和素的交聯(lián)作用將捕獲探針固定在微孔上，制成固相捕獲系統(tǒng)。
其次，在擴增時，引物用抗原（生物素、熒光素酶等）標記，這樣擴增產(chǎn)物中就會代有抗原。
用擴增產(chǎn)物與微孔上的捕獲探針雜交，靶序列被捕獲。再在微孔中加入用辣根過氧化物酶標記的抗體，抗體與靶序列上的抗原結合，再加入底物使之顯色。從而實現(xiàn)定量。
雖然PCR經(jīng)過長時間的探索，PCR－ELISA逐漸成熟，并有了不同的改進版本，但總的還是沒有脫離固相分離、酶標抗體的經(jīng)*疇。
PCR－ELISA的步驟：
1.核酸提取和制備
2.進行PCR擴增
3.微孔預雜交
4.產(chǎn)物雜交
5.顯色
6.檢測分析
PCR－ELISA的優(yōu)點：
人支原體染料法熒光定量PCR試劑盒相對于凝膠光密度定量，無論是靈敏度、特異性、準確度上都是很大的提高，能滿足臨床要求。它為PCR提供了*個嚴格意義上的定量方法。并且對儀器要求較低。只要有擴增儀和酶標儀就可以進行。
PCR－ELISA的不足及消減措施：
1.污染問題嚴重。PCR－ELISA在擴增之后又要進行ELISA反應，而ELISA是一個開放性的反應，特別是洗板，很容易產(chǎn)生污染引起假陽性。為減小污染，一定要嚴格分區(qū)隔離，以避免污染。同時，使用dUTP與UNG酶也可以在一定程度上減小污染的影響。由于PCR產(chǎn)物都是高濃度的。一般情況下，產(chǎn)物都被擴增至2的20方以上，即使避免了擴增前的污染，但同批樣本產(chǎn)物之間的交叉污染可能遠遠大于ELISA，不能忽視。
2.顯色定量分析相對于近的探針熒光分析，無論是靈敏度還是特異性上都有差距。
3.操作繁瑣，這也是嚴重制約臨床應用的重要因素。
