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1 、實(shí)時(shí)PCR原理

番茄潰瘍病菌PCR試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行可重復(fù)性的定量長(zhǎng)期以來(lái)一直是科學(xué)家和研究者的目標(biāo)。傳統(tǒng)的方法需要對(duì)終產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。

這種方法可以確定目的產(chǎn)物和競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)物的大小，估算純度，計(jì)算條帶強(qiáng)度。然而，所用擴(kuò)增試劑和體系的變動(dòng)會(huì)造成擴(kuò)增的終產(chǎn)物的重復(fù)性有較大的變動(dòng)，成為這種方法的主要弊端.

 擴(kuò)增過(guò)程的指數(shù)期提供給我們有用的，可重復(fù)的數(shù)據(jù)。在起始的目的DNA量與循環(huán)過(guò)程的指數(shù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物量之間存在著定量關(guān)系。這正是實(shí)時(shí)擴(kuò)增的基礎(chǔ)。

隨著DNA內(nèi)嵌染料和探針特異性化學(xué)的發(fā)展，實(shí)時(shí)探測(cè)量子學(xué)的跳躍發(fā)展推動(dòng)了對(duì)擴(kuò)增過(guò)程的研究進(jìn)展。

 今天的實(shí)時(shí)設(shè)備由熒光讀數(shù)計(jì)和熱循環(huán)儀組成，用來(lái)監(jiān)測(cè)循環(huán)過(guò)程的熒光。與實(shí)時(shí)設(shè)備相連的計(jì)算機(jī)收集熒光數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)通過(guò)開(kāi)發(fā)的實(shí)時(shí)分析軟件以圖表的形式顯示。

 在擴(kuò)增的每個(gè)循環(huán)中至少收集一次熒光數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增的實(shí)時(shí)監(jiān)控。用戶能夠根據(jù)一個(gè)一個(gè)的循環(huán)知道那個(gè)樣品正在擴(kuò)增。這些即時(shí)的數(shù)據(jù)允許用戶看清楚各個(gè)樣本相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照是如何擴(kuò)增的。用戶不僅能在擴(kuò)增過(guò)程中監(jiān)督整個(gè)反應(yīng)，還可以根據(jù)反饋的信息來(lái)優(yōu)化相應(yīng)程序。因此增加了敏感性，特異性和有效性。

 原始數(shù)據(jù)收集后可以開(kāi)始分析。實(shí)時(shí)設(shè)備的軟件能使收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行正常化處理來(lái)彌補(bǔ)背景熒光的差異。正?；罂梢栽O(shè)定域值水平，這就是分析熒光數(shù)據(jù)的水平。

 樣品到達(dá)域值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱為Ct值（限制點(diǎn)的循環(huán)數(shù)）。域值應(yīng)設(shè)定在使指數(shù)期的擴(kuò)增效率為大，這樣可以獲得準(zhǔn)確，可重復(fù)性的數(shù)據(jù)。如果同時(shí)擴(kuò)增的還有標(biāo)有相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，線性回歸分析將產(chǎn)生一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以用來(lái)計(jì)算未知樣品的濃度。

 2、 探測(cè)化學(xué)物質(zhì)

 有5種主要類型的探測(cè)化學(xué)物質(zhì)用于實(shí)時(shí)擴(kuò)增，包括：

 2.1 內(nèi)嵌染料

 2.2 雙標(biāo)記探針

 2.3 FRET探針

 2.4 分子信標(biāo)

 2.5 Ampliflor

 2.1內(nèi)嵌染料（Sybr-Green I ）

 內(nèi)嵌染料，例如Sybr-Green I ，能與雙鏈DNA結(jié)合

　　1 SG不與單鏈DNA結(jié)合，熒光信號(hào)強(qiáng)度較低

　　2 SG與雙鏈DNA結(jié)合，熒光信號(hào)強(qiáng)度極大的增強(qiáng)

番茄潰瘍病菌PCR試劑盒SG是一種熒光染料，能結(jié)合到DNA雙螺旋的小溝。處于溶解狀態(tài)的未結(jié)合染料顯示低的熒光強(qiáng)度，一旦結(jié)合到雙鏈DNA之后熒光信號(hào)增強(qiáng)。這種特性被利用在實(shí)時(shí)擴(kuò)增中。由于在擴(kuò)增反應(yīng)中DNA增加，染料結(jié)合到擴(kuò)增產(chǎn)物上，熒光信號(hào)增強(qiáng)。

熒光信號(hào)相對(duì)背景水平的增加進(jìn)行分析。根據(jù)擴(kuò)增子的長(zhǎng)度有多個(gè)熒光染料的分子結(jié)合到雙鏈DNA上。內(nèi)嵌染料可以和所有其他傳統(tǒng)擴(kuò)增成分，例如水，緩沖液，MgCl2，dNTPs,Taq-聚合酶，引物和模板一起加到擴(kuò)增反應(yīng)管中。

因?yàn)椴恍枰O(shè)計(jì)序列特異性探針和新的引物對(duì)，這種方法是一種簡(jiǎn)便，性價(jià)比較高的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)方法。