甲酰胺嘧啶-DNA糖基化酶(Fpg)

 Fpg (formamidopyrimidine [fapy]-DNAglycosylase，甲酰胺嘧啶 [fapy]-DNA 糖基化酶）也稱作8-氧代niao嘌呤 DNA 糖基化酶，既有 N-端糖基化酶活性也有 AP-裂解酶活性。N-端糖基化酶活性可以切下雙鏈DNA 上受損的嘌呤堿基，產(chǎn)生一個(gè)脫嘌呤（AP）位點(diǎn)。
AP-裂解酶活性可以切割 AP 位點(diǎn)的 3′ 或 5′ 端，因此可以除去 AP 位點(diǎn)，產(chǎn)生一個(gè)具有 3′ 和 5′ 磷酸的堿基缺口。被 Fpg 識(shí)別并切除的受損堿基包括：7,8-二羥基-8-氧代niao嘌呤（8-氧代niao嘌呤）、8-羥基腺嘌呤、fapyniao嘌呤、甲基-fapy-niao嘌呤、fapy-腺嘌呤、黃曲霉毒素B1-fapy-niao嘌呤、5-羥基-胞嘧啶和 5-羥基niao嘧啶。
活性定義：1 單位指在 10 μl 反應(yīng)體系中，37℃條件下，1 小時(shí)內(nèi)能夠切割 1 pmol 含單個(gè)與胞嘧啶配對(duì)的 8-氧代niao嘌呤的 34 bp 寡核苷酸雙鏈所需要的酶量定義為一個(gè)活性單位。
熱失活：60°C，10min。
反應(yīng)條件：10 mM Bis-Tris（pH 7.0），10 mM MgCl2 ，1mMDTT, 100 μg/ml BSA，37℃ 溫育。
酶儲(chǔ)存液：50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1mM EDTA, 50% Glycerol, pH 7.5。
儲(chǔ)存：置于-20°C 可保存 2 年，避免反復(fù)凍融。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，第鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。