實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR工作原理：此次介紹熒光染料法，目前常用的熒光染料是SYBR Green I，是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料，在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)。因此SYBR Green I的熒光信號(hào)強(qiáng)度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號(hào)檢測(cè)出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。

在學(xué)習(xí)實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)處理之前，我們首先需要了解一下它的數(shù)學(xué)原理，Ct值為什么是我們數(shù)據(jù)處理過程中的一個(gè)關(guān)鍵的因素。這兩個(gè)圖顯示的是實(shí)時(shí)定量PCR的一組結(jié)果。上圖是原始的線性圖譜，下圖則是處理過的指數(shù)圖譜，但是它們兩者表示的是同樣的意思。x-軸表示PCR 循環(huán)數(shù)，y-軸表示擴(kuò)增反應(yīng)的熒光值，也就是擴(kuò)增產(chǎn)物的量。這個(gè)圖中有基線、閾值、Ct值這幾個(gè)概念，從這幾個(gè)值我們能夠最終得到模板中目的基因的含量。

（1）那么什么是基線？如紅色框所指，基線就是擴(kuò)增曲線中的水平部分。在反應(yīng)最初階段，雖然產(chǎn)物是指數(shù)級(jí)增長，但是由于總量太少，其熒光處于背景水平，檢測(cè)不到熒光增加。因此基線信號(hào)的產(chǎn)生是由于測(cè)量的偶然誤差引起的。然而當(dāng)累積了足夠的擴(kuò)增產(chǎn)物，足以產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào)時(shí)，這個(gè)信號(hào)的值就被稱為閾值，如紅色箭頭所指。通常閾值默認(rèn)為基線信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差×10。在閾值的前后，PCR的反應(yīng)仍然是指數(shù)級(jí)增長的，因此此時(shí)的PCR結(jié)果可靠，可以準(zhǔn)確地反映體系中模板的初始量。Ct值是信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到閾值時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)，也就是擴(kuò)增曲線與閾值的交叉點(diǎn)，如圖中的紅點(diǎn)所指。

（2）我們可以看到圖的右邊顯示了擴(kuò)增曲線的4個(gè)階段：基線期、指數(shù)增長期、線性增長期和平臺(tái)期。其中在基線期和指數(shù)增長期，擴(kuò)增產(chǎn)物都是以指數(shù)級(jí)增長的，但是在基線期我們沒有辦法檢測(cè)；而到了線性期和平臺(tái)期之后，由于不同基因，或者不同條件下其擴(kuò)增效率差別很大，因此沒有辦法計(jì)算模板的含量。因此，在指數(shù)增長期的Ct值就成為了計(jì)算模板含量的一個(gè)關(guān)鍵值。

（3）那么，為什么知道了Ct值就能夠得到最初的目的基因含量呢？圖中表示一個(gè)基因的單次反應(yīng)擴(kuò)增曲線。上面這個(gè)公式計(jì)算的是擴(kuò)增產(chǎn)物的分子數(shù)N，它等于模板的分子數(shù)乘以1+擴(kuò)增效率的n次方，n代表循環(huán)次數(shù)。也就是說，如果擴(kuò)增效率為100%，產(chǎn)物分子數(shù)就等于模板數(shù)乘以2的n次方。但是顯然，在線性增長期和平臺(tái)期，擴(kuò)增效率不可能是100%，因此上述PCR理論方程只在指數(shù)期成立，也就是綠色框的部分。