熒光標記

　　熒光修飾可以通過共價鍵的形式連接在多肽序列的N端或C端，但是更推薦在N端進行修飾。以下為合生生物常用熒光修飾以及發(fā)光顏色。

    

　　多肽熒光標記結(jié)合成像技術(shù)后可用于識別特定靶點。共聚焦或熒光顯微鏡的體外成像仍然是研究細胞內(nèi)各種生物過程和相互作用十分有效的方法之一。與蛋白質(zhì)不同，這些肽定位于肌動蛋白上的特定靶點，不易聚集蛋白質(zhì)，因此非常適合于體外跟蹤。同樣，F(xiàn)ITC標記的CPP也可被用于細胞內(nèi)組分的成像，且其細胞毒性低。

　　其中，F(xiàn)ITC是一種胺活性的熒光染料，可廣泛的用于標記多肽和蛋白質(zhì)。合生生物在N端標記Fitc，都會建議在后面一個氨基和由異硫氰酸酯與氨基反應產(chǎn)生的硫脲鍵之間引入烷基間隔器（alkyl spacer）如AJYS（Ahx）。鏈接切割需要酸性環(huán)境，在N端標記FITC的多肽需經(jīng)歷環(huán)化作用來形成熒光素，通常會伴有后面一個氨基酸的去除，但當有一個間隔器如AJYS，或者是通過非酸性環(huán)境將目的肽從樹脂上切下來時，這種情況可避免。空間位阻被認為是在熒光染料前使用Ahx的主要原因，而不是為什么FITC不能直接偶聯(lián)在多肽上的原因。

　　下圖是合生生物多肽熒光標記經(jīng)典案例之一：

　　合成FITC-Ahx-RAKWNNTLKQIASK的MS&HPLC圖譜

　　對于較長的序列，建議使用FRET pairs(fluorescence resonance energy transfer pairs)進行修飾。

　　熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）是描述兩個熒光團之間的能量轉(zhuǎn)移的機制。由于FRET效率部分基于供體和受體分子之間的距離，因此該技術(shù)通常用于研究酶效率，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用或其他分子動力學。

　　圖1.蛋白酶研究的FRET機制。

　　(當肽保持完整時，受體分子將淬滅供體分子，并且不會檢測到熒光。如果序列被蛋白酶活性切割，則受體將不再淬滅供體，并且將檢測到熒光信號)

　　FRET肽是研究肽酶特異性的便利工具，由于其反應過程可被連續(xù)監(jiān)測，為酶活性的檢測提供了一個便捷的方法。

　　供體/受體對的肽鍵水解后產(chǎn)生的熒光可衡量納摩爾級濃度的酶活性。當FRET肽是完整的，表現(xiàn)出的是內(nèi)部的熒光猝滅，但當供體/受體對的任何肽鍵斷裂就會釋放出熒光，此熒光可被連續(xù)檢測，從而可對酶的活性進行定量分析。

　　FRET肽可作為各類酶研究的合適底物，比如：

　　1.肽酶、蛋白酶、激酶、磷酸酶的動力特征和功能特征。

　　2.對新的蛋白水解酶的篩選和檢測。

　　3.對多肽折疊的構(gòu)象研究。