實(shí)驗(yàn)方案

儲(chǔ)備溶液配制

Fluo-8® AM 原液配制

在高質(zhì)量無(wú)水 DMSO 中制備 2 至 5 mM Fluo-8® AM 儲(chǔ)備溶液。

工作溶液配制

Fluo-8® AM 工作解決方案
在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將 Fluo-8® AM 溶解在 DMSO 中或?qū)⒌确值闹甘緞﹥?chǔ)備溶液解凍至室溫。使用 0.04% Pluronic® F-127 在您選擇的緩沖液（例如 Hanks 和 Hepes 緩沖液）中制備 2 至 20 µM 的染料工作溶液。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞系，建議使用終濃度為 4-5 μM 的 Fluo-8® AM。必須根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定細(xì)胞加載所需的確切指示劑濃度。
注意 非離子洗滌劑 Pluronic® F-127 有時(shí)用于增加 Fluo-8® AM 的水溶性。可以從百螢進(jìn)行購(gòu)買。
注意 如果您的細(xì)胞含有有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，則可將丙*舒 (1-2 mM) 添加到染料工作溶液中（孔中的終濃度為 0.5-1 mM）以減少去酯化指示劑的泄漏?？梢詮?百螢購(gòu)買各種 ReadiUse 丙*舒產(chǎn)品，包括水溶性、鈉鹽和穩(wěn)定溶液。

操作步驟

1.在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中制備細(xì)胞過夜。
2.第二天，將 1X Fluo-8® AM 工作溶液添加到您的細(xì)胞板中。
注意：如果您的化合物會(huì)干擾血清，請(qǐng)?jiān)诩虞d染料之前用新鮮的 HHBS 緩沖液替換生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
3.在 37°C 的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育 30 到 60 分鐘。
注意 將染料孵育 2 小時(shí)以上可以提高某些細(xì)胞系的信號(hào)強(qiáng)度。
4.用 HHBS 或您選擇的緩沖液（含有陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑，如 1 mM 丙*舒）替換染料工作溶液，以去除任何多余的探針。
5.根據(jù)需要添加刺激物，并使用配備有 FITC 濾光片組的熒光顯微鏡或 FDSS、FLIPR 或 FlexStation的熒光板讀取器在 490/525 nm 截止波長(zhǎng) 515 nm 處檢測(cè)熒光。