使用細胞活力指標AM酯類

       AM酯是非極性酯，其易于穿過活細胞膜，并且通過活細胞內(nèi)的細胞酯酶快速水解。 AM酯廣泛用于非侵入性地將各種極性熒光探針加載到活細胞中。 但是，使用AM酯時必須小心，因為它們易于水解，特別是在溶液中。 它們應在使用前重新配制成高質(zhì)量的無水二甲基亞砜（DMSO）。DMSO儲備溶液可以在20℃下干燥儲存并避光。 在這些條件下，AM酯應穩(wěn)定數(shù)月。

       以下是我們推薦的將AM酯加載到活細胞中的方案。 該說明書僅提供指南，實際應根據(jù)您的具體需求進行修改。

a）在高質(zhì)量無水DMSO中制備2至5mM AM酯的儲備溶液。非離子洗滌劑Pluronic®F-127有時用于增加AM酯的水溶性。

注意：在稀釋到上樣緩沖液中之前，可將等體積的20％Pluronic®F-127溶液添加到細胞活力指示劑的DMSO儲備溶液中。終的Pluronic®F-127濃度約為0.02％。

注意：不建議在Pluronic®F-127存在下長期儲存AM酯。

b）在實驗當天，要么將細胞活力的固體指示劑溶解在DMSO中，要么將等分的指示劑儲備溶液解凍至室溫。在您選擇的緩沖液（如Hanks和Hepes緩沖液）中制備1至10μM的工作溶液。對于大多數(shù)細胞系，建議終濃度范圍為4至5μM的細胞活力指標。細胞加載所需指標的確切濃度必須根據(jù)經(jīng)驗確定。

c）如果您的細胞含有有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白，可以在細胞培養(yǎng)基中加入丙H舒（1-2.5 mM）或磺吡酮（0.1-0.25 mM），以減少脫酯化指標的泄漏。在室溫或37℃下將細胞與AM酯孵育20分鐘至1小時。

d）在不含細胞活力指示劑的緩沖液（含有陰離子轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑，如果適用）中洗滌細胞以除去過量的探針。

注意：通過流式細胞術(shù)立即分析細胞樣品，以確定在零時間沒有洗滌的每個細胞的平均熒光。

e）在所需的Ex / Em波長下進行實驗 。