使用鈣指示劑AM酯類

1.使用鈣指示劑AM Esters加載細(xì)胞：

AM酯是非極性酯，其易于穿過活細(xì)胞膜，并且通過活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞酯酶快速水解。 AM酯廣泛用于非侵入性地將各種極性熒光探針裝載到活細(xì)胞中。 但是，使用AM酯時(shí)必須小心，因?yàn)樗鼈円子谒?，特別是在溶液中。 它們應(yīng)該用高質(zhì)量的無水二甲基亞砜（DMSO）重新配制。 DMSO儲備溶液應(yīng)在-20°C下干燥儲存并避光。 在這些條件下，AM酯應(yīng)穩(wěn)定數(shù)月。

以下是我們推薦的將AM酯加載到活細(xì)胞中的方案。 該方案僅提供指南，實(shí)際應(yīng)根據(jù)您的具體需求進(jìn)行修改。

a）在高質(zhì)量無水DMSO中制備2至5 mM AM酯原液。

b）在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將鈣指示劑溶解在DMSO中或?qū)⒌确莸闹甘緞﹥淙芤航鈨鲋潦覝?。使?.04％Pluronic®F-127在您選擇的緩沖液（如Hanks和Hepes緩沖液）中制備2至20μM的工作溶液。 對于大多數(shù)細(xì)胞系，我們建議鈣指示劑的終濃度為4-5 uM。細(xì)胞加載所需指標(biāo)的確切濃度必須根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。為避免因過載和潛在染料毒性引起的任何偽影，建議使用可產(chǎn)生足夠信號強(qiáng)度的小探針濃度。

注意：非離子洗滌劑Pluronic®F-127有時(shí)用于增加鈣指示劑AM酯的水溶性。

c）如果您的細(xì)胞（如CHO細(xì)胞）含有有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以將丙*舒（2-5 mM）或磺吡酮（0.2-0.5 mM）添加到染料工作溶液中（終濃度為1） 丙*舒為-2.5 mM，對于磺吡酮為0.1-0.25 mM，以減少去酯化指標(biāo)的泄漏。

d）將等體積的染料工作溶液（來自步驟b或c）加入細(xì)胞板中。

e）將染料加載板室在溫度或37℃下孵育20分鐘（特別是Fluo-8AM）至2小時(shí)，然后將板在室溫下再孵育30分鐘。

注意1：降低加載溫度可能會減少指示符的劃分。

注意2：孵育Cal-520 AM超過2小時(shí)可以為某些細(xì)胞系提供更好的信號強(qiáng)度

f）用HHBS或您選擇的緩沖液（含有陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑，如1mM丙*舒，如果適用）替換染料工作溶液，以去除多余的探針。

g）在所需的Ex / Em波長下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（見說明書）。