使用鈣指示劑AM酯類

1.使用鈣指示劑AM Esters加載細(xì)胞：

AM酯是非極性酯，其易于穿過活細(xì)胞膜，并且通過活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞酯酶快速水解。AM酯廣泛用于非侵入性地將各種極性熒光探針裝載到活細(xì)胞中。但是，使用AM酯時必須小心，因?yàn)樗鼈円子谒?，特別是在溶液中。它們應(yīng)該用高質(zhì)量的無水二甲基亞砜（DMSO）重新配制。DMSO儲備溶液應(yīng)在-20°C下干燥儲存并避光。在這些條件下，AM酯應(yīng)穩(wěn)定數(shù)月。

以下是我們推薦的將AM酯加載到活細(xì)胞中的方案。該協(xié)議僅提供指南，應(yīng)根據(jù)您的具體需求進(jìn)行修改。

a）在高質(zhì)量無水DMSO中制備2至5 mM AM酯原液。

b）在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將鈣指示劑溶解在DMSO中或?qū)⒌确莸闹甘緞﹥淙芤航鈨鲋潦覝?。使?.04％Pluronic®F-127在您選擇的緩沖液（如Hanks和Hepes緩沖液）中制備2至20μM的工作溶液。對于大多數(shù)細(xì)胞系，我們建議鈣指示劑的終濃度為4-5 uM。細(xì)胞加載所需指標(biāo)的確切濃度必須根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。為避免因過載和潛在染料毒性引起的任何偽影，建議使用可產(chǎn)生足夠信號強(qiáng)度的小探針濃度。

注意：非離子洗滌劑Pluronic®F-127有時用于增加鈣指示劑AM 酯的水溶性。

c）如果您的細(xì)胞（如CHO細(xì)胞）含有有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以將丙*舒（2-5 mM）或磺吡酮（0.2-0.5 mM）添加到染料工作溶液中（終濃度為1）對于丙*舒而言為-2.5mM，對于磺胺吡喃酮為0.1-0.25mM，以減少脫酯化指示劑的泄漏。

d）將等體積的染料工作溶液（來自步驟b或c）加入細(xì)胞板中。

e）將染料加載板室在溫度或37℃下孵育20分鐘（特別是Fluo-8AM）至2小時，然后將板在室溫下再孵育30分鐘。

f） 用HHBS或您選擇的緩沖液（含有陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑，如1mM丙*舒，如果適用）替換染料工作溶液，以去除多余的探針。

g）在所需的Ex / Em波長下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.測量細(xì)胞內(nèi)鈣響應(yīng)：

圖1. 沒有丙*舒的CHO-M1細(xì)胞中內(nèi)源性P2Y受體對ATP的反應(yīng)。在96孔黑壁/透明底板中，將CHO-M1細(xì)胞以每100μL/孔40,000個細(xì)胞接種過夜。將100μl的4μMFluo -3AM，F(xiàn)luo- 4AM 或Cal202®AM在HHBS中加入孔中，并將細(xì)胞在37℃下孵育2小時。用100μlHHBS替換染料加載培養(yǎng)基，加入50μl300μMATP，然后使用FITC通道用熒光顯微鏡（Olympus IX71）成像。

圖2. 用Cal-520 或Fluo-4 AM 測量的CHO-K1細(xì)胞中ATP刺激的內(nèi)源性P2Y受體的鈣響應(yīng)。在96孔黑壁/透明底板中，將CHO-K1細(xì)胞以每100μL /孔50,000個細(xì)胞接種過夜。100μL的5 μ 中號的Fluo-4 AM或校準(zhǔn)- 520® AM與（A）或不具有（B）2.5mM丙*舒加入到細(xì)胞中，并將細(xì)胞在37下溫育?下進(jìn)行2小時。 通過FlexStation（Molecular Devices）添加ATP（50μL/孔）以達(dá)到終指示的濃度。

使用鈣指示劑鹽

為了確定溶液的游離鈣濃度或 單波長鈣指示劑的K d，使用以下等式：

[Ca] = K d [F - F min ] / F max - F]

       其中F是實(shí)驗(yàn)鈣水平下指示劑的熒光，F(xiàn) min 是不存在鈣時的熒光，F(xiàn) max是鈣飽和探針的熒光。解離常數(shù)（K d）是探針對鈣的親和力的量度。與校準(zhǔn)溶液相比，熒光指示劑的Ca 2+結(jié)合和光譜性質(zhì)在細(xì)胞環(huán)境中變化非常顯著。 細(xì)胞內(nèi)指標(biāo)的原位校準(zhǔn)通常產(chǎn)生顯著高于體外測定的K d值。 通過將加載的細(xì)胞暴露于受控的Ca來進(jìn)行原位校準(zhǔn) 在離子載體存在下的2+緩沖液，例如A-23187,4-溴A-23187和離子霉素?；蛘?，細(xì)胞透化劑如洋地黃皂苷或X-100可用于將指示劑暴露 于細(xì)胞外培養(yǎng)基的受控Ca 2+水平。表1列出了一些鈣試劑的K d值供您參考。

使用鈣指示劑結(jié)合物

       與游離離子指示劑相比，這些相同指示劑的葡聚糖綴合物表現(xiàn)出減少的區(qū)室化和低得多的染料滲漏率。由于葡聚糖的分子量，凈電荷，標(biāo)記程度和染料的性質(zhì)可能影響實(shí)驗(yàn)，因此建議研究人員查閱主要文獻(xiàn)以獲得特定應(yīng)用的信息。