使用Cal-520 AM，Cal-570 AM或Cal-630 AM酯類

1.使用Cal-520 ，Cal-590 或Cal-630 AM酯：

       AM酯是非極性酯，其易于穿過活細(xì)胞膜，并且通過活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞酯酶快速水解。AM酯廣泛用于非侵入性地將各種極性熒光探針裝載到活細(xì)胞中。但是，使用AM酯時(shí)必須小心，因?yàn)樗鼈円子谒?，特別是在溶液中。它們應(yīng)在使用前重新配制成高質(zhì)量的無水二甲基亞砜（DMSO）。DMSO儲備溶液可以在-20℃下干燥儲存并避光。在這些條件下，AM酯應(yīng)穩(wěn)定數(shù)月。以下是我們推薦的將Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM酯加入活細(xì)胞的方案。該方案僅提供指南，實(shí)際應(yīng)根據(jù)您的具體需求進(jìn)行修改。

a）在高質(zhì)量無水DMSO中制備2至5 mM Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM酯的儲備溶液。

b）在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM溶解在DMSO中或?qū)⒌确莸闹甘緞﹥淙芤航鈨鲋潦覝?。在Hanks和Hepes緩沖液（HHBS）或您選擇的緩沖液（0.04％Pluronic®F-127）中制備10至20μM的染料工作溶液。細(xì)胞加載所需指示劑的確切濃度必須憑經(jīng)驗(yàn)確定。

注意：非離子型洗滌劑Pluronic®F-127有時(shí)用于增加Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM酯的水溶性。

c）如果您的細(xì)胞（如CHO細(xì)胞）含有有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可將*磺舒（1-2 mM）加入染料工作溶液中（濃度為0.5-1 mM）以減少滲漏去酯化指標(biāo)。

d）將等體積的染料工作溶液（來自步驟b或c）加入細(xì)胞板中。

e）將染料加載板在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育60至90分鐘，然后在室溫下將板孵育另外30分鐘。

注意：孵育染料超過2小時(shí)可以為某些細(xì)胞系提供更好的信號強(qiáng)度。

f）用HHBS或您選擇的緩沖液（含有陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑，如1mM*磺舒，如果適用）替換染料工作溶液，以去除多余的探針。

g）在Ex / Em = 490 / 525nm（對于Cal-520 AM），540 / 5000nm（對于Cal-590 AM）或600 / 640nm（對于Cal-630 AM）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.測量細(xì)胞內(nèi)鈣響應(yīng)：

為了確定溶液的游離鈣濃度或單波長鈣指示劑的Kd，使用以下等式：

[Ca]free = Kd[F ─ Fmin]/Fmax ─ F]

其中F是實(shí)驗(yàn)鈣水平下指示劑的熒光，F(xiàn)min是不存在鈣時(shí)的熒光，F(xiàn)max是鈣飽和探針的熒光。

       解離常數(shù)（Kd）是探針對鈣的親和力的量度。 與校準(zhǔn)溶液相比，熒光指示劑的Ca結(jié)合和光譜性質(zhì)在細(xì)胞環(huán)境中變化非常顯著。 細(xì)胞內(nèi)指標(biāo)的原位反應(yīng)校準(zhǔn)通常產(chǎn)生顯著高于體外測定的Kd值。 通過在離子載體如A-23187,4-溴A-23187和離子霉素存在下將加載的細(xì)胞暴露于受控的Ca2+緩沖液來進(jìn)行原位校準(zhǔn)。 或者，細(xì)胞透化劑如洋地黃皂苷或X-100可用于將指示劑暴露于細(xì)胞外培養(yǎng)基的受控Ca2+水平。