鈣離子熒光探針Cal-520  NHS酯 生物試劑 生物*和生物胞素與抗生物*蛋白和鏈霉親和素都具有高親和力結(jié)合。由于生物*和生物胞素是相對較小的分子，因此生物*和生物胞素可以與許多生物分子綴合而不會顯著改變靶分子的生物活性。Cal-520-生物*和Cal-520生物*結(jié)合物具有很好的鈣反應(yīng)。他們的抗生物*蛋白和鏈霉親和素復(fù)合物具有敏感的鈣反應(yīng)。可以想象的是，可以將Cal-520-生物*和Cal-520生物*結(jié)合物與IgG-抗生物*蛋白或IgG-鏈霉親和素結(jié)合物結(jié)合，以針對特定靶標(biāo)在空間上監(jiān)測鈣的變化。百螢生物為您提供優(yōu)質(zhì)的鈣離子熒光探針Cal-520  NHS酯 生物試劑、

使用Cal-520 AM，Cal-570 AM或Cal-630 AM酯類

1.使用Cal-520 ，Cal-590 或Cal-630 AM酯：

       AM酯是非極性酯，其易于穿過活細(xì)胞膜，并且通過活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞酯酶快速水解。AM酯廣泛用于非侵入性地將各種極性熒光探針裝載到活細(xì)胞中。但是，使用AM酯時(shí)必須小心，因?yàn)樗鼈円子谒猓貏e是在溶液中。它們應(yīng)在使用前重新配制成高質(zhì)量的無水二甲基亞砜（DMSO）。DMSO儲備溶液可以在-20℃下干燥儲存并避光。在這些條件下，AM酯應(yīng)穩(wěn)定數(shù)月。以下是我們推薦的將Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM酯加入活細(xì)胞的方案。該方案僅提供指南，實(shí)際應(yīng)根據(jù)您的具體需求進(jìn)行修改。

a）在高質(zhì)量無水DMSO中制備2至5 mM Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM酯的儲備溶液。

b）在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM溶解在DMSO中或?qū)⒌确莸闹甘緞﹥淙芤航鈨鲋潦覝亍Ｔ贖anks和Hepes緩沖液（HHBS）或您選擇的緩沖液（0.04％Pluronic®F-127）中制備10至20μM的染料工作溶液。細(xì)胞加載所需指示劑的確切濃度必須憑經(jīng)驗(yàn)確定。

注意：非離子型洗滌劑Pluronic®F-127有時(shí)用于增加Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM酯的水溶性。

c）如果您的細(xì)胞（如CHO細(xì)胞）含有有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可將*磺舒（1-2 mM）加入染料工作溶液中（濃度為0.5-1 mM）以減少滲漏去酯化指標(biāo)。

d）將等體積的染料工作溶液（來自步驟b或c）加入細(xì)胞板中。

e）將染料加載板在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育60至90分鐘，然后在室溫下將板孵育另外30分鐘。

注意：孵育染料超過2小時(shí)可以為某些細(xì)胞系提供更好的信號強(qiáng)度。

f）用HHBS或您選擇的緩沖液（含有陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑，如1mM*磺舒，如果適用）替換染料工作溶液，以去除多余的探針。

g）在Ex / Em = 490 / 525nm（對于Cal-520 AM），540 / 5000nm（對于Cal-590 AM）或600 / 640nm（對于Cal-630 AM）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.測量細(xì)胞內(nèi)鈣響應(yīng)：

為了確定溶液的游離鈣濃度或單波長鈣指示劑的Kd，使用以下等式：

[Ca]free = Kd[F ─ Fmin]/Fmax ─ F]

其中F是實(shí)驗(yàn)鈣水平下指示劑的熒光，F(xiàn)min是不存在鈣時(shí)的熒光，F(xiàn)max是鈣飽和探針的熒光。

       解離常數(shù)（Kd）是探針對鈣的親和力的量度。 與校準(zhǔn)溶液相比，熒光指示劑的Ca結(jié)合和光譜性質(zhì)在細(xì)胞環(huán)境中變化非常顯著。 細(xì)胞內(nèi)指標(biāo)的原位反應(yīng)校準(zhǔn)通常產(chǎn)生顯著高于體外測定的Kd值。 通過在離子載體如A-23187,4-溴A-23187和離子霉素存在下將加載的細(xì)胞暴露于受控的Ca2+緩沖液來進(jìn)行原位校準(zhǔn)。 或者，細(xì)胞透化劑如洋地黃皂苷或X-100可用于將指示劑暴露于細(xì)胞外培養(yǎng)基的受控Ca2+水平。

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