操作步驟

1.使用鈣指示劑AM Esters加載細胞：

       AM酯是非極性酯，其易于穿過活細胞膜，并且通過活細胞內(nèi)的細胞酯酶快速水解。 AM酯廣泛用于非侵入性地將各種極性熒光探針裝載到活細胞中。 但是，使用AM酯時必須小心，因為它們易于水解，特別是在溶液中。 它們應(yīng)該用高質(zhì)量的無水二甲基亞砜（DMSO）重新配制。 DMSO儲備溶液應(yīng)在-20°C下干燥儲存并避光。 在這些條件下，AM酯應(yīng)穩(wěn)定數(shù)月。

以下是我們推薦的將AM酯加載到活細胞中的方案。 該方案僅提供指南，實際應(yīng)根據(jù)您的具體需求進行修改。

a）在高質(zhì)量無水DMSO中制備2至5 mM AM酯原液。

b）在實驗當(dāng)天，將鈣指示劑溶解在DMSO中或?qū)⒌确莸闹甘緞﹥淙芤航鈨鲋潦覝亍Ｊ褂?.02％Pluronic®F-127在您選擇的緩沖液（如Hanks和Hepes緩沖液）中制備1至10μM的工作溶液。對于大多數(shù)細胞系，我們建議鈣指示劑的終濃度為4-5 uM。細胞加載所需指標的確切濃度必須根據(jù)經(jīng)驗確定。為避免因過載和潛在染料毒性引起的任何偽影，建議使用可產(chǎn)生足夠信號強度的小探針濃度。

c）如果您的細胞含有有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白，可以在細胞培養(yǎng)基中加入丙*舒（1-2.5 mM）或磺吡酮（0.1-0.25 mM），以減少脫酯化指標的泄漏。在室溫或37°C下用鈣指示劑酯孵育細胞20分鐘至1小時。

d）在HHBS或您選擇的緩沖液（含有陰離子轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑，如2.5mM丙*舒，如果適用）中洗滌細胞1-2次以除去過量的探針。

e）在所需的Ex / Em波長下進行實驗。

2.測量細胞內(nèi)鈣響應(yīng)：

       為了確定溶液的游離鈣濃度或單波長鈣指示劑的Kd，使用等式：[Ca]free = Kd[F - Fmin]/Fmax - F]

       其中F是實驗鈣水平下指示劑的熒光，F(xiàn)min是不存在鈣時的熒光，F(xiàn)max是鈣飽和探針的熒光。 解離常數(shù)（Kd）是探針對鈣的親和力的量度。 與校準溶液相比，熒光指示劑的Ca2 +結(jié)合和光譜性質(zhì)在細胞環(huán)境中變化非常顯著。 細胞內(nèi)指標的原位校準通常產(chǎn)生顯著高于體外測定的Kd值。 通過在離子載體如A-23187,4-溴A-23187和離子霉素存在下將加載的細胞暴露于受控的Ca 2+緩沖液來進行原位校準。 或者，細胞透化劑如洋地黃皂苷或X-100可用于將指示劑暴露于細胞外培養(yǎng)基的受控Ca2 +水平。 說明書中的表1列出了一些鈣試劑的Kd值供您參考。