樣品實(shí)驗(yàn)方案

簡(jiǎn)要概述

1. 在測(cè)定緩沖液中準(zhǔn)備細(xì)胞

2. 添加Calbryte 520 AM染料加載溶液（1 µL）

3. 在37°C孵育30分鐘

4. 清洗細(xì)胞

5. 添加鈣通量激動(dòng)劑

6. 在530/30 nm濾光片（FITC通道）使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度

溶液配制

儲(chǔ)備溶液配制

Calbryte 520 AM儲(chǔ)備溶液（500X）：在Calbryte 520 AM儲(chǔ)備溶液（組分A）的小瓶中加入100 µL DMSO（未提供），并充分混合。 注意：100 µL Calbryte 520 AM儲(chǔ)備溶液足以進(jìn)行100次測(cè)定。 如果試管密封嚴(yán)密，可以將未使用的Calbryte 520 AM原液分裝并在<-20°C下保存超過一個(gè)月。 避光并避免重復(fù)的凍融循環(huán)。

實(shí)驗(yàn)步驟

1.除去細(xì)胞培養(yǎng)基，并加入0.5 mL測(cè)定緩沖液。注意：對(duì)于貼壁細(xì)胞和非貼壁細(xì)胞，建議分別使用4 x 105 – 8 x 105和1 x 106-2 X 106。每個(gè)細(xì)胞系應(yīng)根據(jù)個(gè)體情況進(jìn)行評(píng)估，以確定細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)員的細(xì)胞密度。

2.將1µL Calbryte 520 AM儲(chǔ)備溶液（500X）加到0.5 mL非標(biāo)準(zhǔn)或貼壁細(xì)胞的測(cè)定緩沖液（組分B）中。注意：如果細(xì)胞（例如CHO細(xì)胞）含有有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，則可將丙h舒（組分C）添加到染料工作溶液中（孔濃度將為0.125-1 mM），以減少去離子水的泄漏。

3.將細(xì)胞在37°C下孵育30分鐘。

4.對(duì)于非貼壁細(xì)胞，將細(xì)胞離心并去除染料。將細(xì)胞重懸于0.4 mL HHBS（組分D）中。對(duì)于貼壁細(xì)胞，使用0.5 mM EDTA輕輕地將細(xì)胞從板中提起并離心。將細(xì)胞重懸于0.4 mL HHBS（組分D）中。注意：要從板上分離貼壁細(xì)胞，可以考慮使用酶試劑（例如胰dan白酶，Accutase），但需要進(jìn)行測(cè)試以確保細(xì)胞表面上的目標(biāo)受體不受影響。

5.用HHBS或所需的緩沖液制備5X激動(dòng)劑化合物。

6.使用530/30 nm濾光片（FITC通道）在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)，在添加100 µL制備的激動(dòng)劑之前和之后分析樣品。注意：為獲得結(jié)果，重要的是在添加激動(dòng)劑后1分鐘內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。確保激動(dòng)劑添加到實(shí)際讀數(shù)開始之間的時(shí)間對(duì)于所有樣品保持恒定。