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LysoBrite 溶酶體橙色熒光探針 ，用于標(biāo)記活細(xì)胞的溶酶體。專有的溶解性染料可能通過溶酶體pH梯度選擇性地積聚在溶酶體中。溶質(zhì)指示劑是疏水性化合物，易于滲透完整的活細(xì)胞，并在進(jìn)入細(xì)胞后被捕獲在溶酶體中。進(jìn)入溶酶體后，LysoBrite 試劑的熒光明顯增強(qiáng)。可以使用熒光成像，高含量成像，酶標(biāo)儀熒光測定法或流式細(xì)胞術(shù)檢測熒光。 LysoBrite 橙色，紅色，深紅色和NIR試劑具有*的光穩(wěn)定性和優(yōu)異的細(xì)胞保留性，可用于各種研究，包括細(xì)胞粘附，趨化性，多藥耐藥性，細(xì)胞活力，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞毒性。它們適用于增殖和非增殖細(xì)胞，可用于懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞。溶酶體是細(xì)胞器，其含有酸水解酶以分解廢物和細(xì)胞碎片。溶酶體消化多余的或破舊的細(xì)胞器，食物顆粒和吞噬的病毒或細(xì)菌。溶酶體周圍的膜允許消化酶在pH4.5下工作。與微堿性胞質(zhì)溶膠（pH 7.2）相比，溶酶體的內(nèi)部是酸性的（pH 4.5-4.8）。溶酶體通過質(zhì)子泵和氯離子通道從細(xì)胞質(zhì)中泵送質(zhì)子穿過膜來維持這種pH差異。LysoBrite 溶酶體橙色熒光探針 是美國AAT Bioquest研發(fā)的產(chǎn)品。

實(shí)驗(yàn)方案

使用LysoBrite 染料的分析方案

概述

準(zhǔn)備細(xì)胞

添加染料工作溶液

在37°C孵育30分鐘

洗滌細(xì)胞

在熒光顯微鏡下分析

注：該方案僅提供指南，應(yīng)根據(jù)您的具體需求進(jìn)行修改。

操作方法

1.制備溶酶體染色溶液：

1.1解凍 LysoBrite 染料至室溫。

1.2通過將20μL的500 X LysoBrite 染料稀釋到10 mL Hanks和20 mm Hepes緩沖液或緩沖液（HBSS）中，制備染料工作溶液。

注1：對于一個96孔板，20μL的LysoBrite 染料就足夠了。在<-15℃下等分并儲存未使用的LysoBrite 染料儲備溶液。保護(hù)它免受光照，避免反復(fù)凍融循環(huán)。

注2：熒光溶酶體指示劑的濃度根據(jù)具體應(yīng)用而變化。可以根據(jù)特定細(xì)胞類型和細(xì)胞或組織對探針的滲透性來修改染色條件。

2.準(zhǔn)備和染色細(xì)胞：

2.1貼壁細(xì)胞：a.在96孔黑色壁/透明底板（100μL/孔/ 96孔板）中或在裝有適當(dāng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)的蓋玻片上培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到所需的匯合時，加入等體積的染料加工溶液（來自步驟1.2）。 b.將細(xì)胞在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。 c.用預(yù)熱（37℃）Hanks和20mM Hepes緩沖液（HBSS）或您選擇的緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，用HBSS或生長培養(yǎng)基填充細(xì)胞孔。 d.使用配有所需濾光片組的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。

注意：如果細(xì)胞看起來沒有充分染色，建議增加標(biāo)記濃度或孵育時間以使染料積累。

2.2對于懸浮細(xì)胞：a.將等體積的染料加工溶液（來自步驟1.2）加入細(xì)胞中。將細(xì)胞在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。 b.用預(yù)熱（37℃）Hanks和20mM Hepes緩沖液（HBSS）或您選擇的緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，用HBSS或生長培養(yǎng)基填充細(xì)胞孔。 c.使用配備有所需過濾器組的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。

注1：如果細(xì)胞看起來沒有充分染色，建議增加標(biāo)記濃度或培養(yǎng)時間以使染料積累。

注2：懸浮細(xì)胞可以附著在用BD Cell-Tak®（BD Biosciences）處理過的蓋玻片上，并作為粘附細(xì)胞染色（見步驟2.1）。