樣品分析

1.準(zhǔn)備線粒體染色溶液：

1.1將所有組件溫度調(diào)至室溫。

1.2通過(guò)將20μLMitolite Orange（組分A）稀釋到10mL活細(xì)胞染色緩沖液（組分B）中制備染料工作溶液。

注1：對(duì)于一個(gè)96孔板，20μL的500X Mitolite Orange（組分A）就足夠了。在≤-20oC下等分并儲(chǔ)存未使用的500X Mitolite Orange。避光，避免反復(fù)凍融循環(huán)。

注2：熒光線粒體指示劑的濃度根據(jù)具體應(yīng)用而變化。可以根據(jù)特定細(xì)胞類(lèi)型和細(xì)胞或組織對(duì)探針的滲透性來(lái)修改染色條件。

2.準(zhǔn)備和染色細(xì)胞：

2.1對(duì)于粘附細(xì)胞：在96孔黑色墻壁/透明底板上或在裝有適當(dāng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)的蓋玻片上培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到所需的匯合時(shí)，加入等體積（例如對(duì)于96孔板為100μL，對(duì)于384孔板為25μL）的染料加工溶液（來(lái)自步驟1.2）。將細(xì)胞在37oC，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育30分鐘至2小時(shí)。用Hanks和20mM Hepes緩沖液（HH緩沖液）或您選擇的緩沖液（例如濃度為1：1的生長(zhǎng)培養(yǎng)基緩沖液）替換染料上樣溶液。

注意：如果細(xì)胞看起來(lái)沒(méi)有充分染色，建議增加標(biāo)記濃度或孵育時(shí)間以使染料積累。

2.2對(duì)于懸浮細(xì)胞：以1000rpm離心細(xì)胞5分鐘以獲得細(xì)胞沉淀并吸出上清液。在預(yù)熱（37℃）生長(zhǎng)培養(yǎng)基中輕輕重懸細(xì)胞沉淀，并加入等體積的染料加工溶液（來(lái)自步驟1.2）。將細(xì)胞在37oC，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育30分鐘至2小時(shí)。用Hanks和20mM Hepes緩沖液（HH緩沖液）或您選擇的緩沖液（例如濃度為1：1的生長(zhǎng)培養(yǎng)基緩沖液）替換染料上樣溶液。

注1：如果細(xì)胞看起來(lái)沒(méi)有充分染色，建議增加標(biāo)記濃度或培養(yǎng)時(shí)間以使染料積累。

注2：懸浮細(xì)胞可以附著在用BD Cell-Tak®（BD Biosciences）處理過(guò)的蓋玻片上，并作為粘附細(xì)胞染色（見(jiàn)步驟2.1）。