Bucculite FdU 細(xì)胞增殖熒光成像試劑盒是美國AAT Bioquest生產(chǎn)的用于檢測細(xì)胞活力的試劑盒，檢測細(xì)胞增殖是評估細(xì)胞活力、細(xì)胞周期和基因毒性的可靠方法之一。檢測細(xì)胞增殖的一種基本方法是在細(xì)胞生長的 S 期期間在胸苷存在的情況下測量 DNA 合成。 該細(xì)胞增殖熒光成像試劑盒使用 FOL-FdU，一種胸苷類似物。 FOL-FdU 在 DNA 合成過程中被整合到細(xì)胞 DNA 中。固定細(xì)胞后，通過我們的 Buccutite 標(biāo)記技術(shù)用 MTA-iFluor 488 標(biāo)記摻入的 FOL-FdU。細(xì)胞中形成的 iFluor 488 標(biāo)記 DNA 在 FITC 通道中可以被熒光儀器檢測到。該 細(xì)胞增殖熒光成像試劑盒提供了一種替代抗 BrdU 抗體的檢測和 EdU 點(diǎn)擊化學(xué)檢測的方法。它是一種環(huán)境友好的無銅檢測方法，用于在單細(xì)胞水平上檢測活性 DNA 合成。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Bucculite FdU 細(xì)胞增殖熒光成像試劑盒。

樣品實驗方案

簡要概述

1.準(zhǔn)備細(xì)胞（對于96孔板為100 µL /孔，對于384孔板為25 µL /孔）

2.對于96孔板，以100 µL /孔添加2X FOL-FdU工作溶液

3.在37oC下孵育3小時

4.取出培養(yǎng)基，并在室溫下用100µL冰冷的90％甲醇的PBS溶液固定細(xì)胞15分鐘

5.除去固定液并用PBS洗滌3次

6.加入1X iFluor 488-MTA工作溶液（100 µL /孔）并在室溫下染色30分鐘。

7.除去每個孔中的工作溶液，并用1X洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞3次。

8.加入100µL 1X洗滌緩沖液/孔，并用FITC濾光片組觀察紫外熒光顯微鏡。

溶液配制

1.儲備溶液配制

所有未使用的儲備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

1.1 FOL-FdU儲備溶液（1000X）：
將500 µL DMSO（組分E）添加到FOL-FdU（組分A）中，制成1000X儲備溶液。注意：此1000X濃度是使用具有FOL-dU濃度的HeLa細(xì)胞開發(fā)的。生長培養(yǎng)基，細(xì)胞密度，細(xì)胞類型變化和其他因素可能會影響標(biāo)記。我們建議測試一系列FOL-FdU濃度，以確定適合您的細(xì)胞類型和實驗條件的濃度。

1.2 iFluor 488-MTA儲備溶液（400X）：
將50 µL DMSO（組分E）添加到iFluor 488-MTA（組分B）中，制成400 X iFluor 488-MTA儲備溶液。

2.工作溶液

2.1 X FOL-FdU工作溶液

在培養(yǎng)基中將1000X FOL-FdU儲備溶液稀釋500倍，以制備2X FOL-FdU工作溶液。

2.2 X iFluor 488-MTA工作溶液

將2.5 µL 400X iFluor 488-MTA儲備溶液添加到1mL染色緩沖液（組分C）中，以制備1X iFluor 488-MTA工作溶液。

2.3 X洗滌緩沖液

向9mL PBS中加入1mL 10X洗滌緩沖液（組分D），制成1X Washing Buffer。

操作步驟

1.準(zhǔn)備細(xì)胞

1.1對于貼壁細(xì)胞：將細(xì)胞在生長培養(yǎng)基中以10,000至40,000個細(xì)胞/孔/ 100 µL（對于96孔板）過夜培養(yǎng)，以2,500至10,000個細(xì)胞/孔/ 20 µL（對于384孔板）過夜培養(yǎng)。

1.2對于非貼壁細(xì)胞：離心培養(yǎng)液中的細(xì)胞，并將細(xì)胞沉淀以1-2 X 106細(xì)胞/ ml（對于10個96孔板為10 mL）懸浮在培養(yǎng)液中。注意：應(yīng)單獨(dú)評估每個細(xì)胞系，以確定細(xì)胞密度。

2.用FOL-FdU標(biāo)記細(xì)胞

2.1將等體積的2X FOL-FdU工作溶液添加到含有要處理的細(xì)胞的培養(yǎng)基中，以在每個孔中獲得1X FOL-FdU溶液。我們不建議更換所有培養(yǎng)基，因為這可能會影響細(xì)胞增殖速率。

2.2在適合細(xì)胞類型的條件下孵育細(xì)胞3小時。FOL-FdU暴露于細(xì)胞的時間可以直接測量合成DNA的細(xì)胞。孵育時間取決于細(xì)胞生長速率。

3.細(xì)胞固定

3.1孵育后，移出培養(yǎng)基，并向每個孔中加入100µL冰冷的PBS中的90％甲醇（未提供，甲醇/ PBS，v / v為90/10），并在室溫下孵育15分鐘。

3.2除去固定緩沖液，并用PBS清洗每個孔中的細(xì)胞兩次。

4.染色細(xì)胞

4.1在細(xì)胞板中加入100 µL /孔（96孔板）或50 µL /孔（384孔板）的1X iFluor™488-MTA工作溶液。在避光的條件下，將細(xì)胞與工作溶液在室溫下孵育30分鐘。

4.2除去每個孔中的工作溶液。

4.3用1X洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞3次，洗滌后每孔加入100µL洗滌緩沖液。注意：如果需要Hoechst 33342染色劑，請在1X洗滌緩沖液中制成5-10 µg / ml Hoechst 33342溶液并染色30分鐘。

4.4使用帶有FITC濾光片組的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中的熒光信號。