樣本標記分析

注意：該標記方案是針對山羊抗小鼠IgG與ICG的綴合物開發(fā)的。

1.準備蛋白質(zhì)儲備溶液（溶液A）：

將100L反應(yīng)緩沖液（例如，1M碳酸鈉溶液或1M磷酸鹽緩沖液，pH~9.0）與900L目標蛋白質(zhì)溶液（例如抗體，蛋白質(zhì)濃度> 2mg / ml，）混合，得到1 mL蛋白標記儲備液。

注意1：蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的pH值應(yīng)為8.5±0.5。 如果蛋白質(zhì)溶液的pH低于8.0，則需使用1M碳S氫鈉溶液或1M pH 9.0磷酸鹽緩沖液將pH調(diào)節(jié)至8.0-9.0的范圍。

注意2：蛋白質(zhì)應(yīng)溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中。如果蛋白質(zhì)溶解在Tris或甘an酸緩沖液中，則必須用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去用于蛋白質(zhì)沉淀的游離胺或銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）。

注意3：牛血清白蛋白（BSA）、明膠穩(wěn)定不純的抗體等標記的效果不理想。 疊D化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應(yīng)。 可以通過透析或旋轉(zhuǎn)柱除去疊D化鈉或硫柳汞，以獲得標記結(jié)果。

注意4：如果蛋白質(zhì)濃度低于2 mg / mL，則結(jié)合效率明顯降低。 為獲得標記效率，建議蛋白質(zhì)濃度范圍為2-10 mg / mL。

2.準備染料儲備溶液（溶液B）：

將無水DMSO加入到ICG染料小瓶中以制備10-20mM儲備溶液。 通過移液或渦旋混合均勻。

注意：在開始綴合之前準備染料儲備溶液（溶液B），現(xiàn)配現(xiàn)用，保持溶液新鮮。 染料儲備溶液的長期儲存可降低染料活性。 溶液B可以在不受光照和潮濕的情況下儲存在冰箱中兩周。 避免凍融循環(huán)。

3.確定染料/蛋白質(zhì)比例（可選）：

注意：每種蛋白質(zhì)都需要不同的染料/蛋白質(zhì)比例，這也取決于染料的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的過度標記可能對其結(jié)合親和力產(chǎn)生不利影響，而低染料/蛋白質(zhì)比率的蛋白質(zhì)綴合物會降低靈敏度。我們建議您通過使用連續(xù)不同量的標記染料溶液重復步驟4和5來實驗確定染料/蛋白質(zhì)比率。通常，對于大多數(shù)染料 - 蛋白質(zhì)綴合物，推薦使用4-6種染料/蛋白質(zhì)。

3.1使用10：1摩爾比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）作為起點：將5μl染料儲備溶液（溶液B，假設(shè)染料儲備溶液為10 mM）加入到樣品瓶中，蛋白質(zhì)溶液（95μl溶液A）。假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為10mg / mL并且蛋白質(zhì)的分子量為~200KD，蛋白質(zhì)的濃度為~0.05mM。

注意：蛋白質(zhì)溶液中DMSO的濃度應(yīng)<10％。

3.2運行結(jié)合反應(yīng)（見下面的步驟4）。

3.3重復＃3.2，溶液B /溶液A的摩爾比為5：1;分別為15：1和20：1。

3.4使用預制的旋轉(zhuǎn)柱純化所需的綴合物。

3.5計算上述4種結(jié)合物的染料/蛋白質(zhì)比例（DOS）。

3.6運行上述4種綴合物的功能檢測，確定的染料/蛋白質(zhì)比例，以擴大標記反應(yīng)。

4.運行綴合反應(yīng)：

4.1在有效搖動下，將適量的染料儲備溶液（溶液B）加入到蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的小瓶中。

注意：溶液B /溶液的摩爾比由步驟3.6確定。 如果跳過步驟3，我們建議使用10：1摩爾比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）。

4.2繼續(xù)在室溫下旋轉(zhuǎn)或搖動反應(yīng)混合物30-60分鐘。

5.純化綴合物

以下方案是使用Sephadex G-25柱純化染料 - 蛋白質(zhì)綴合物的實例。

5.1按照制造說明準備Sephadex G-25色譜柱。

5.2將反應(yīng)混合物（直接來自步驟4）加載到Sephadex G-25柱的頂部。

5.3樣品在頂部樹脂表面下方運行時，加入PBS（pH 7.2-7.4）。

5.4將更多PBS（pH 7.2-7.4）加入所需樣品中以完成柱純化。

注意1：對于立即使用時，染料 - 蛋白質(zhì)偶聯(lián)物需要用染色緩沖液稀釋，并等分多次使用。

注意2：對于長期儲存，染料 - 蛋白質(zhì)綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥。