樣本神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)記方案

該樣品標(biāo)記方案用于用iFluor 488標(biāo)記神經(jīng)元細(xì)胞。 您可能需要針對(duì)特定細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

1.準(zhǔn)備染料儲(chǔ)備液：

1.1將1mg iFluor 488溶解在100μl200mMKCl中以制備10mM溶液（10mg / ml）。

1.2通過過濾對(duì)上述溶液進(jìn)行滅菌。

2.標(biāo)記細(xì)胞：

2.1通過使超極化電流通過電極，用iFluor 488儲(chǔ)備溶液（來自步驟1）標(biāo)記神經(jīng)元細(xì)胞（例如，Manduca sexta幼蟲中的附屬植物qian開器運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元）。

3.固定細(xì)胞：

3.1用4％多聚甲醛在100mM磷酸鹽緩沖液（pH 7）中固定細(xì)胞30分鐘。

樣本糖蛋白標(biāo)記方案

該標(biāo)記方案被開發(fā)用于山羊抗小鼠IgG與iFluor 647酰肼的綴合。您可能需要進(jìn)一步優(yōu)化您的特定蛋白質(zhì)。

1.準(zhǔn)備蛋白質(zhì)醛溶液（溶液A）：

1.1將5mg山羊抗小鼠IgG抗體溶于0.5mL 0.1M乙酸鈉，0.15M NaCl，pH5.5中

注意：確保蛋白質(zhì)濃度> 10 mg / ml，以獲得標(biāo)記效率。

1.2通過離心30-60分鐘，用0.2ml的100mM高碘酸鈉（21mg / ml）處理蛋白質(zhì)溶液。

1.3加入30μL乙二醇終止反應(yīng)。

2.準(zhǔn)備染料儲(chǔ)備溶液（溶液B）：

2.1將1mg iFluor 染料酰肼溶解在0.1ml DMSO中以制備10mg / ml染料儲(chǔ)備溶液。通過移液或渦旋混合均勻。

3.運(yùn)行綴合反應(yīng)：

3.1在有效搖動(dòng)下將10μL染料儲(chǔ)備溶液（溶液B）加入50μL蛋白質(zhì)溶液（溶液A）中。

3.2繼續(xù)在室溫下旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)反應(yīng)混合物，在黑暗中保持30-60分鐘。

4.純化綴合物（以下方案是使用Sephadex G-25柱純化染料 - 蛋白質(zhì)綴合物的實(shí)例。）

4.1根據(jù)制造說明準(zhǔn)備Sephadex G-25色譜柱。

4.2將反應(yīng)混合物（直接從步驟3）加載到Sephadex G-25柱的頂部。

4.3一旦樣品在頂部樹脂表面下方運(yùn)行，就加入PBS（pH 7.2-7.4）。

4.4向所需樣品中加入更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成柱純化。

注1：為立即使用，染料 - 蛋白質(zhì)偶聯(lián)物可以等分多次使用，而對(duì)于長期儲(chǔ)存，需要濃縮或冷凍干燥蛋白質(zhì)結(jié)合物溶液。

注2：對(duì)于小規(guī)模標(biāo)記，建議使用即用型旋轉(zhuǎn)商用色譜柱以方便使用。