mFluor Violet 450 馬來(lái)酰亞胺  染料是美國(guó)AAT Bioquest生產(chǎn)的熒光標(biāo)記染料，AAT Bioquest的mFluor 染料專為多色流式細(xì)胞儀應(yīng)用而開(kāi)發(fā)。這些染料具有大的斯托克斯位移，并且可以通過(guò)流式細(xì)胞儀的激光線（例如，405nm，488nm和633nm）很好地激發(fā)。mFluor Violet 450染料的熒光激發(fā)和發(fā)射大值分別為~405 nm和~450 nm。這些光譜特性使其成為Pacific Blue 標(biāo)記染料的替代品。mFluor Violet 450馬來(lái)酰亞胺是穩(wěn)定的，并且與巰基顯示出良好的反應(yīng)性和選擇性。mFluor Violet 450馬來(lái)酰亞胺提供了一種方便的工具，可用于標(biāo)記單克隆，多克隆抗體或其他蛋白質(zhì)（> 10 kDa），用于紫外激光激發(fā)的流式細(xì)胞儀應(yīng)用。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的mFluor Violet 450 馬來(lái)酰亞胺  染料。

操作方法

注意：該標(biāo)記方案是針對(duì)山羊抗小鼠IgG與mFluor 450 SE的綴合物開(kāi)發(fā)的。 您需根據(jù)您的實(shí)際情況而定。

1.準(zhǔn)備蛋白質(zhì)儲(chǔ)備溶液（溶液A）：

將100μL反應(yīng)緩沖液（如1 M碳酸鈉溶液或1 M磷酸鹽緩沖液，pH~9.0）與900μL目標(biāo)蛋白溶液（如抗體，蛋白質(zhì)濃度> 2 mg / ml，如果可能）混合至100μL給1 mL蛋白質(zhì)標(biāo)記原液。

注1：蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的pH值應(yīng)為8.5±0.5。如果蛋白質(zhì)溶液的pH低于8.0，則使用1M碳酸an鈉溶液或1M pH 9.0磷酸鹽緩沖液將pH調(diào)節(jié)至8.0-9.0的范圍。

注2：蛋白質(zhì)應(yīng)溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中。如果蛋白質(zhì)溶解在Tris或甘D酸緩沖液中，則必須用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去廣泛用于蛋白質(zhì)沉淀的游離胺或銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）。

注3：用牛血清白蛋白（BSA）或明膠穩(wěn)定的不純抗體或抗體不能很好標(biāo)記。疊D化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應(yīng)?？梢酝ㄟ^(guò)透析或旋轉(zhuǎn)柱除去疊D化鈉或硫柳汞，以獲得標(biāo)記結(jié)果。

注4：如果蛋白質(zhì)濃度低于2 mg / mL，則結(jié)合效率顯著降低。為獲得標(biāo)記效率，建議蛋白質(zhì)濃度范圍為2-10 mg / mL。

2.準(zhǔn)備染料儲(chǔ)備溶液（溶液B）：

將無(wú)水DMSO加入到mFluor 染料SE小瓶中以制備10-20mM儲(chǔ)備溶液。 通過(guò)移液或渦旋混合均勻。

注意：在開(kāi)始綴合之前準(zhǔn)備染料儲(chǔ)備溶液（溶液B）及時(shí)使用。 染料儲(chǔ)備溶液的長(zhǎng)期儲(chǔ)存可降低染料活性。 溶液B可以在不受光照和潮濕的情況下儲(chǔ)存在冰箱中兩周。 避免凍融循環(huán)。

3.確定染料/蛋白質(zhì)比例（可選）：

注意：每種蛋白質(zhì)都需要不同的染料/蛋白質(zhì)比例，這也取決于染料的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的過(guò)度標(biāo)記可能對(duì)其結(jié)合親和力產(chǎn)生不利影響，而低染料/蛋白質(zhì)比率的蛋白質(zhì)結(jié)合物會(huì)降低靈敏度。 我們建議您通過(guò)使用連續(xù)不同量的標(biāo)記染料溶液重復(fù)步驟4和5來(lái)實(shí)驗(yàn)確定染料/蛋白質(zhì)比率。通常，對(duì)于大多數(shù)染料 - 蛋白質(zhì)綴合物，推薦使用4-6種染料/蛋白質(zhì)。

3.1使用10：1摩爾比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）作為起始點(diǎn)：將5μl染料儲(chǔ)備溶液（溶液B，假設(shè)染料儲(chǔ)備溶液為10 mM）加入到樣品瓶中。蛋白質(zhì)溶液（95μl溶液A）有效搖動(dòng)。假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為10mg / mL并且蛋白質(zhì)的分子量為~200KD，蛋白質(zhì)的濃度為~0.05mM。

注意：蛋白質(zhì)溶液中DMSO的濃度應(yīng)<10％。

3.2進(jìn)行綴合反應(yīng)（參見(jiàn)下面的步驟4）。

3.3重復(fù)＃3.2，溶液B /溶液A的摩爾比為5：1; 分別為15：1和20：1。

3.4使用預(yù)制的旋轉(zhuǎn)柱純化所需的綴合物。

3.5計(jì)算上述4種結(jié)合物的染料/蛋白質(zhì)比（DOS）。

3.6運(yùn)行上述4種結(jié)合物的功能測(cè)試，以確定的染料/蛋白質(zhì)比例，以擴(kuò)大您的標(biāo)記反應(yīng)。

4.運(yùn)行結(jié)合反應(yīng)：

4.1在有效搖動(dòng)下，將適量的染料儲(chǔ)備溶液（溶液B）加入到蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的小瓶中。

注意：溶液B /溶液的摩爾比由步驟3.6確定。 如果跳過(guò)步驟3，我們建議使用10：1摩爾比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）。

4.2繼續(xù)在室溫下旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)反應(yīng)混合物30-60分鐘。

5.純化綴合物

以下方案是使用Sephadex G-25柱純化染料 - 蛋白質(zhì)綴合物的實(shí)例。

5.1按照制造說(shuō)明準(zhǔn)備Sephadex G-25色譜柱。

5.2將反應(yīng)混合物（直接從步驟4）加載到Sephadex G-25柱的頂部。

5.3樣品在樹(shù)脂頂部表面下方運(yùn)行后立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。

5.4向所需樣品中加入更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成色譜柱純化。 合并含有所需染料 - 蛋白質(zhì)綴合物的級(jí)分。

注1：立即使用時(shí)，染料 - 蛋白質(zhì)偶聯(lián)物需要用染色緩沖液稀釋，并等分多次使用。

注2：對(duì)于長(zhǎng)期儲(chǔ)存，染料 - 蛋白質(zhì)結(jié)合物溶液需要濃縮或冷凍干燥