trFluor Eu穴狀化合物琥珀酰亞胺酯熒光染料是美國(guó)AAT Bioquest生產(chǎn)的，存在于細(xì)胞，血清或其他生物流體中的許多生物化合物是天然熒光的，因此使用常規(guī)的快速熒光團(tuán)導(dǎo)致測(cè)定靈敏度的嚴(yán)重限制，這是由于待測(cè)定的生物分子的自發(fā)熒光引起的高背景。使用長(zhǎng)壽命熒光團(tuán)結(jié)合時(shí)間分辨檢測(cè)（激發(fā)和發(fā)射檢測(cè)之間的延遲）可以大限度地減少瞬間熒光干擾。我們的trFluor™Cryptate Eu琥珀酰亞胺酯具有高的穩(wěn)定性和良好的水溶性。與其他商業(yè)Cryptate Eu探針相比，trFluor™Cryptate Eu琥珀酰亞胺酯僅具有單一反應(yīng)性基團(tuán)，交聯(lián)的可能性。與更傳統(tǒng)的熒光團(tuán)如Alexa Fluor或花青染料相比，這些trFluor™Eu探針具有較大的斯托克斯位移和極長(zhǎng)的發(fā)射半衰期。與其他TRF化合物相比，我們的trFluor™Cryptate Eu探針具有高的穩(wěn)定性，高發(fā)射產(chǎn)率和選擇性標(biāo)記生物分子的能力。此外，我們的trFluor™Eu探針在與抗體等生物聚合物結(jié)合時(shí)對(duì)熒光猝滅不敏感。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的trFluor Eu穴狀化合物琥珀酰亞胺酯熒光染料。

染色樣本分析

操作步驟

1.準(zhǔn)備蛋白質(zhì)儲(chǔ)備溶液（溶液A）：

將100μL反應(yīng)緩沖液（如1 M碳酸鈉溶液或1 M磷酸鹽緩沖液，pH~9.0）與900μL目標(biāo)蛋白溶液（如抗體，蛋白質(zhì)濃度> 2 mg / ml，如果可能）混合至100μL給予1 mL蛋白質(zhì)標(biāo)記原液。

注1：蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的pH值應(yīng)為8.5±0.5。如果蛋白質(zhì)溶液的pH低于8.0，則使用1M碳S氫鈉溶液或1M pH 9.0磷酸鹽緩沖液將pH調(diào)節(jié)至8.0-9.0的范圍。

注2：蛋白質(zhì)應(yīng)溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中。如果蛋白質(zhì)溶解在Tris或甘an酸緩沖液中，則必須用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去廣泛用于蛋白質(zhì)沉淀的游離胺或銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）。

注3：用牛血清白蛋白（BSA）或明膠穩(wěn)定的不純抗體或抗體不能很好標(biāo)記。疊D化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應(yīng)。可以通過(guò)透析或旋轉(zhuǎn)柱除去疊D化鈉或硫柳汞，以獲得標(biāo)記結(jié)果。

注4：如果蛋白質(zhì)濃度低于2 mg / mL，則結(jié)合效率會(huì)顯著降低。為獲得標(biāo)記效率，建議極終蛋白質(zhì)濃度范圍為2-10 mg / mL。

2.準(zhǔn)備染料儲(chǔ)備溶液（溶液B）：

將無(wú)水DMSO加入到iFluor 染料SE小瓶中以制備10-20mM儲(chǔ)備溶液。 通過(guò)移液或渦旋混合均勻。

注意：在開(kāi)始綴合前準(zhǔn)備染料儲(chǔ)備溶液（溶液B）。 及時(shí)使用。 染料儲(chǔ)備溶液的長(zhǎng)期儲(chǔ)存可降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存兩周，避光保存。 避免凍融循環(huán)。

3.確定染料/蛋白質(zhì)比例（可選）：

注意：每種蛋白質(zhì)都需要不同的染料/蛋白質(zhì)比例，這也取決于染料的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的過(guò)度標(biāo)記可能不利地影響其結(jié)合親和力，而低染料/蛋白質(zhì)比率的蛋白質(zhì)綴合物會(huì)降低靈敏度。我們建議您通過(guò)使用連續(xù)不同量的標(biāo)記染料溶液重復(fù)步驟4和5來(lái)實(shí)驗(yàn)確定染料/蛋白質(zhì)比率。通常，對(duì)于大多數(shù)染料 - 蛋白質(zhì)綴合物，推薦使用4-6種染料/蛋白質(zhì)。

3.1使用10：1摩爾比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）作為起始點(diǎn)：將5μl染料儲(chǔ)備溶液（溶液B，假設(shè)染料儲(chǔ)備溶液為10 mM）加入到樣品瓶中。蛋白質(zhì)溶液（95μl溶液A）有效搖動(dòng)。假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為10mg / mL并且蛋白質(zhì)的分子量為~200KD，蛋白質(zhì)的濃度為~0.05mM。

注意：蛋白質(zhì)溶液中DMSO的濃度應(yīng)<10％。

3.2運(yùn)行綴合反應(yīng)（參見(jiàn)下面的步驟4）。

3.3重復(fù)＃3.2，溶液B /溶液A的摩爾比為5：1;分別為15：1和20：1。

3.4使用預(yù)制的旋轉(zhuǎn)柱純化所需的綴合物。

3.5計(jì)算上述4種結(jié)合物的染料/蛋白質(zhì)比（DOS）（見(jiàn)說(shuō)明書(shū)）。

3.6運(yùn)行上述4種結(jié)合物的功能測(cè)試，確定的染料/蛋白質(zhì)比例，以擴(kuò)大標(biāo)記反應(yīng)。

4.運(yùn)行結(jié)合反應(yīng)：

4.1有效加入適量的染料儲(chǔ)備溶液（溶液B）到蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的小瓶中晃動(dòng)。

注意：溶液B /溶液的摩爾比由步驟3.6確定。如果跳過(guò)步驟3，我們建議使用10：1溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）的摩爾比。

4.2繼續(xù)在室溫下旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)反應(yīng)混合物30-60分鐘。

5.純化綴合物

以下方案是使用Sephadex G-25柱純化染料 - 蛋白質(zhì)綴合物的實(shí)例。

5.1按照制造說(shuō)明準(zhǔn)備Sephadex G-25色譜柱。

5.2將反應(yīng)混合物（直接從步驟4）加載到Sephadex G-25柱的頂部。

5.3樣品在頂部樹(shù)脂表面下方運(yùn)行時(shí)立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。

5.4向所需樣品中加入更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成色譜柱純化。 合并含有所需染料 - 蛋白質(zhì)綴合物的級(jí)分。

注1：立即使用時(shí)，染料 - 蛋白質(zhì)偶聯(lián)物需要用染色緩沖液稀釋，并等分多次使用。

注2：對(duì)于長(zhǎng)期儲(chǔ)存，染料 - 蛋白質(zhì)綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥