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Ex?(nm)	562	Em?(nm)	623
分子量	N/A	溶劑	DMSO
儲存條件	在零下15度以下保存,?避免光照

iFluor® 605 琥珀酰亞胺酯熒光標(biāo)記染料 是iFluor系列熒光標(biāo)記染料之一，可以覆蓋整個可見光譜。所有iFluor 染料都具有優(yōu)異的水溶性，它們的親水性使有機(jī)溶劑的使用極小化。與常規(guī)的染料(如FITC，TRITC，Texas Red ，Cy3 ，Cy5和Cy7)相比，iFluor 染料具有更好的標(biāo)記性能。一些iFluor 染料在某些抗體上明顯優(yōu)于Alexa Fluor 標(biāo)記染料。它們是用于標(biāo)記蛋白質(zhì)和核酸的極便宜的熒光染料（替代Alexa Fluor 染料）。每種iFluor染料的開發(fā)都與特定的Alexa Fluor 或其他標(biāo)記染料（如DyLight 染料）的光譜特性相匹配。

琥珀酰亞胺基（NHS）酯被證明是用于胺修飾的試劑，因?yàn)樾纬傻孽０锋I基本上與天然肽鍵相同并且穩(wěn)定。這些試劑通常是穩(wěn)定的并且與脂族胺顯示出良好的反應(yīng)性和選擇性。當(dāng)琥珀酰亞胺酯化合物用于綴合反應(yīng)時(shí)，需要考慮的因素很少：1.溶劑：在大多數(shù)情況下，活性染料應(yīng)溶于無水二甲基甲酰胺（DMF）或二甲基亞砜（DMSO）中。 2.反應(yīng)pH：胺與琥珀酰亞胺酯的標(biāo)記反應(yīng)強(qiáng)烈依賴于pH。胺反應(yīng)性試劑與非質(zhì)子化脂族胺基團(tuán)反應(yīng)，包括蛋白質(zhì)的末端胺和賴氨酸的β-氨基。因此，胺酰反應(yīng)通常在pH 7.5以上進(jìn)行。被琥珀酰亞胺酯修飾的蛋白質(zhì)是具有代表性的，通常在pH 8.5-9.5下合成。 3.反應(yīng)緩沖液：使用胺反應(yīng)試劑時(shí)，必須避免使用含有游離胺（如Tris和甘an酸）和硫醇化合物的緩沖液。廣泛用于蛋白質(zhì)沉淀的銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）也必須在進(jìn)行染料綴合之前除去（例如通過透析）。 4.反應(yīng)溫度：大多數(shù)綴合在室溫下進(jìn)行。特定標(biāo)記反應(yīng)可能需要升高或降低的溫度。iFluor系列染料是AF系列染料的替代品。百螢生物為您提供優(yōu)質(zhì)的iFluor® 605 琥珀酰亞胺酯熒光標(biāo)記染料。

實(shí)驗(yàn)方案

染色樣本分析

操作步驟

1.準(zhǔn)備蛋白質(zhì)儲備溶液（溶液A）：

將100μL反應(yīng)緩沖液（如1 M碳酸鈉溶液或1 M磷酸鹽緩沖液，pH~9.0）與900μL目標(biāo)蛋白溶液（如抗體，蛋白質(zhì)濃度> 2 mg / ml，如果可能）混合至100μL，再加入1 mL蛋白質(zhì)標(biāo)記原液。

注1：蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的pH值應(yīng)為8.5±0.5。如果蛋白質(zhì)溶液的pH低于8.0，則使用1M碳S氫鈉溶液或1M pH 9.0磷酸鹽緩沖液將pH調(diào)節(jié)至8.0-9.0的范圍。

注2：蛋白質(zhì)應(yīng)溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中。如果蛋白質(zhì)溶解在Tris或甘an酸緩沖液中，則必須用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去廣泛用于蛋白質(zhì)沉淀的游離胺或銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）。

注3：不純的抗體、穩(wěn)定的牛血清蛋白（BSA）抗體或明膠不會被很好的標(biāo)記。疊D化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應(yīng)?？梢酝ㄟ^透析或旋轉(zhuǎn)柱除去疊D化鈉或硫柳汞，以獲得標(biāo)記結(jié)果。

注4：如果蛋白質(zhì)濃度低于2 mg / mL，則結(jié)合效率會顯著降低。為獲得標(biāo)記效率，建議蛋白質(zhì)濃度范圍為2-10 mg / mL。

2.準(zhǔn)備染料儲備溶液（溶液B）：

將無水DMSO加入到iFluor 染料SE小瓶中以制備10-20mM儲備溶液。通過移液或渦旋混合均勻。

注意：在開始綴合前準(zhǔn)備染料儲備溶液（溶液B），及時(shí)使用。染料儲備溶液的長期儲存可降低染料活性。溶液B可在冰箱中保存兩周，避光保存。避免凍融循環(huán)。

3.確定染料/蛋白質(zhì)比例（可選）：

注意：每種蛋白質(zhì)都需要不同的染料/蛋白質(zhì)比例，這也取決于染料的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的過度標(biāo)記可能影響其結(jié)合親和力，而低染料/蛋白質(zhì)比率的蛋白質(zhì)綴合物會降低靈敏度。我們建議您通過使用連續(xù)不同量的標(biāo)記染料溶液重復(fù)步驟4和5來實(shí)驗(yàn)確定染料/蛋白質(zhì)比率。通常，對于大多數(shù)染料 - 蛋白質(zhì)綴合物，推薦使用4-6種染料/蛋白質(zhì)。

3.1使用10：1摩爾比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）作為起始點(diǎn)：將5μl染料儲備溶液（溶液B，假設(shè)染料儲備溶液為10 mM）加入到樣品瓶中。蛋白質(zhì)溶液（95μl溶液A）有效搖動。假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為10mg / mL并且蛋白質(zhì)的分子量為~200KD，蛋白質(zhì)的濃度為~0.05mM。

注意：蛋白質(zhì)溶液中DMSO的濃度應(yīng)<10％。

3.2運(yùn)行綴合反應(yīng)（參見下面的步驟4）。

3.3重復(fù)＃3.2，溶液B /溶液A的摩爾比為5：1;分別為15：1和20：1。

3.4使用預(yù)制的旋轉(zhuǎn)柱純化所需的綴合物。

3.5計(jì)算上述4種結(jié)合物的染料/蛋白質(zhì)比（DOS）。

3.6檢測上述4種結(jié)合物，確定的染料/蛋白質(zhì)比例，以擴(kuò)大標(biāo)記反應(yīng)。

4.運(yùn)行結(jié)合反應(yīng)：

4.1有效加入適量的染料儲備溶液（溶液B）到蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的小瓶中晃動。

注意：溶液B /溶液的摩爾比由步驟3.6確定。如果跳過步驟3，我們建議使用10：1溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）的摩爾比。

4.2繼續(xù)在室溫下旋轉(zhuǎn)或搖動反應(yīng)混合物30-60分鐘。

5.純化綴合物

以下方案是使用Sephadex G-25柱純化染料 - 蛋白質(zhì)綴合物的實(shí)例。

5.1按照說明書準(zhǔn)備Sephadex G-25色譜柱。

5.2將反應(yīng)混合物（直接從步驟4）加載到Sephadex G-25柱的頂部。

5.3樣品在頂部樹脂表面下方運(yùn)行時(shí)立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。

5.4向所需樣品中加入更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成色譜柱純化。

注1：立即使用時(shí)，染料 - 蛋白質(zhì)偶聯(lián)物需要用染色緩沖液稀釋，并等分多次使用。

注2：對于長期儲存，染料 - 蛋白質(zhì)綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥。

圖示

圖1.將HeLa細(xì)胞與（Tubulin +）或（Tubulin-）小鼠抗微管蛋白一起孵育，然后與iFluor 488山羊抗小鼠IgG綴合物（綠色，左）和AlexaFluor®488山羊抗小鼠IgG綴合物（綠色）一起孵育，右）。細(xì)胞核用Hoechst 33342（藍(lán)色）染色。

圖2.人淋巴細(xì)胞上AlexaFluor®488和iFluor 488抗人CD4的流式細(xì)胞儀分析。在每個測試中，PBMC細(xì)胞都用0.5 ug 488抗人CD4和0.5 ug iFluor 488抗人CD4染色。在ACEA流式細(xì)胞儀系統(tǒng)上進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。