脂多糖( LPS )，也稱為內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分。LPS是脊椎動(dòng)物先天免疫系統(tǒng)的強(qiáng)力刺激劑，可引起發(fā)燒、感染性休克和死亡。它也被認(rèn)為是檢測細(xì)菌病原體入侵的生物標(biāo)志物，負(fù)責(zé)炎癥反應(yīng)和內(nèi)毒素休克的發(fā)展。在生物材料，如蛋白質(zhì)、多肽或抗體樣品中檢測LPS是生物制造和生物加工的一項(xiàng)重要任務(wù)。Amplite 熒光法內(nèi)毒素檢測試劑盒使用Endotoxin Green，一種敏感的熒光底物。Endotoxin Green在內(nèi)毒素和鱟血細(xì)胞提取物( LAL )的存在下水解。Endotoxin Green的水解產(chǎn)物產(chǎn)生強(qiáng)烈的綠色熒光。內(nèi)毒素活性與Endotoxin Green水解產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度成正比。Amplite 熒光法內(nèi)毒素檢測試劑盒可檢測廣泛的內(nèi)毒素(從1 EU / ml到0.001 EU / ml)。它是非常敏感的，可以在30分鐘內(nèi)檢測到低至0.001 EU / mL的內(nèi)毒素。

樣品分析方案

概述

制備Endotoxin Green工作溶液

添加大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品（25µL）

添加鱟溶血酶溶液（25µL）

在37°C下孵育30分鐘

準(zhǔn)備并添加Endotoxin Green工作溶液（50µL）

在10分鐘內(nèi)讀取Ex/Em=490/525 nm時(shí)的熒光強(qiáng)度

溶液配制

儲(chǔ)備溶液配制

1.Endotoxin Green儲(chǔ)備液

將50µL DMSO添加到Endotoxin Green小瓶中（成分A）制成100X Endotoxin Green儲(chǔ)備溶液。

2. 5X LAL細(xì)胞裂解液儲(chǔ)備液

將500µL無內(nèi)毒素水（組分B）加入鱟細(xì)胞裂解液（組分C）小瓶中，制成5X鱟細(xì)胞溶解液溶液。

E、 大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液

將10µL 100 EU/mL大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到990µL無內(nèi)毒素水（組分B）中，生成1 EU/mL的大腸桿菌內(nèi)毒素溶液（ES1）。然后取1 EU/mL大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（ES1），在無內(nèi)毒素水（B組分）中進(jìn)行1:3的連續(xù)稀釋，得到連續(xù)稀釋的大腸桿菌內(nèi)毒素（ES2-ES7）。

工作溶液配制

1. Endotoxin Green工作溶液

添加50µLEndotoxin Green將儲(chǔ)備溶液溶于5mL無內(nèi)毒素水（組分B）中，使總體積為5.05mL Endotoxin Green工作溶液。

2. LAL工作溶液

將500µL鱟細(xì)胞裂解液（LAL）儲(chǔ)備溶液添加到2 mL無內(nèi)毒素水（組分B）中，使總體積為2.5 mL鱟細(xì)胞溶解液（LAL）工作溶液。

注：根據(jù)需要和使用前準(zhǔn)備LAL工作溶液的量。使用無內(nèi)毒素瓶或試管。

操作步驟

表1.大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品在透明底部96孔微孔板中的布局。ES=E。大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)（ES1-ES7，1.00至0.001 EU/mL）；BL=空白對(duì)照；TS=試樣

表2.每個(gè)孔的試劑組成

1.根據(jù)表1和表2中提供的布局，制備大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（ES）、空白對(duì)照品（BL）和測試樣品（TS）。對(duì)于384孔板，每個(gè)孔使用12.5µL試劑，而不是25µL。

2.向大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、空白對(duì)照品和測試樣品的每個(gè)孔中加入25µL 2X鱟鱟裂解液。

3.充分混合并在37°C下孵育30分鐘。

4.添加50µL Endotoxin Green將工作溶液添加到大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、空白對(duì)照品和測試樣品的每個(gè)孔中，使總分析體積為100µL/孔。對(duì)于384孔板，添加25µL Amplite Endotoxin Green將工作溶液注入每個(gè)孔，總體積為50µL/孔。

5.檢測Ex/Em=490/525nm，Cutoff:515nm的熒光強(qiáng)度。

注：為獲得良好結(jié)果，在添加工作溶液后2至10分鐘內(nèi)讀取。 注：可加入25µL 25%乙酸以停止反應(yīng)。