iFluor Ultra 647 琥珀酰亞胺酯 熒光染料 綴合抗體是許多應(yīng)用中鑒定蛋白質(zhì)的一種工具，包括熒光細(xì)胞成像、流式細(xì)胞術(shù)、蛋白質(zhì)印跡、免疫組織化學(xué)等。使用熒光標(biāo)記抗體的優(yōu)勢包括更高的靈敏度、多路復(fù)用能力和易用性。 iFluor Ultra 系列是我們廣受歡迎的 iFluor 染料的新升級版，并針對用于熒光成像和流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用的標(biāo)記抗體進(jìn)行了優(yōu)化。用 iFluor Ultra 647 制備的抗體綴合物遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于其他現(xiàn)有類似染料的綴合物，如 Alexa Fluor® 647。iFluor Ultra 647 綴合物在相同條件下比用 Alexa Fluor® 647 制備的綴合物更亮。此外，iFluor Ultra 647 的熒光不受 pH (4-10) 的影響。 iFluor Ultra 647 SE 染料相當(dāng)穩(wěn)定，并表現(xiàn)出與蛋白質(zhì)氨基的良好反應(yīng)性和選擇性。 iFluor Ultra 647 的光譜特性和反應(yīng)性類似于 Alexa Fluor® 647（Alexa Fluor® 是 ThermoFisher 的商標(biāo)）。百螢生物為您提供優(yōu)質(zhì)的iFluor Ultra 647 琥珀酰亞胺酯 熒光染料 。

實(shí)驗(yàn)方案

儲備溶液配制

1. 蛋白質(zhì)原液（溶液 A）
將 100 µL 反應(yīng)緩沖液（例如，1 M 碳酸鈉溶液或 1 M 磷酸鹽緩沖液，pH ~ 9.0）與 900 µL 目標(biāo)蛋白溶液（例如抗體，如果可能，蛋白質(zhì)濃度 >2 mg/mL）混合，得到 1 mL 蛋白質(zhì)標(biāo)記原液。
注意：蛋白質(zhì)溶液（溶液 A）的 pH 值應(yīng)為 8.5 ± 0.5。如果蛋白質(zhì)溶液的 pH 值低于 8.0，則使用 1 M 碳suan氫鈉溶液或 1 M pH 9.0 磷酸鹽緩沖液將 pH 值調(diào)整到 8.0-9.0 的范圍內(nèi)。
注意：蛋白質(zhì)應(yīng)溶于1X 磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)，pH 7.2-7.4。如果蛋白質(zhì)溶解在 Tris 或甘安酸緩沖液中，則必須用 1X PBS，pH 7.2-7.4 進(jìn)行透析，以去除用于蛋白質(zhì)沉淀的游離胺或銨鹽（如硫酸銨和醋酸銨）。
注意：如果蛋白質(zhì)濃度低于 2 mg/mL，綴合效率會顯著降低。為獲得標(biāo)記效率，建議蛋白質(zhì)濃度范圍為 2-10 mg/mL。

2. iFluor Ultra 647 SE 原液（溶液 B）
將無水 DMSO 添加到 iFluor Ultra 647 SE 小瓶中，制成 10 mM 儲備溶液。通過移液或渦旋混合均勻。
注意：在開始綴合之前準(zhǔn)備染料儲備溶液（溶液 B），并及時(shí)使用。染料原液的長期儲存可能會降低染料活性。溶液 B 在避光和防潮的情況下可以在冰箱中儲存兩周，避免凍融循環(huán)。

操作步驟

該標(biāo)記方案是為山羊抗小鼠 IgG 與 iFluor Ultra 647 SE 的綴合而開發(fā)的。 您可能需要進(jìn)一步優(yōu)化您的特定蛋白質(zhì)。
注意：每種蛋白質(zhì)需要不同的染料/蛋白質(zhì)比例，這也取決于染料的特性。 蛋白質(zhì)的過度標(biāo)記會對其綴合親和力產(chǎn)生不利影響，而低染料/蛋白質(zhì)比率的蛋白質(zhì)綴合物會降低靈敏度。

1.進(jìn)行綴合反應(yīng)
1.1使用 10:1 的溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白質(zhì)）的摩爾比作為起點(diǎn)：將 5 μL 的染料儲備溶液（溶液 B，假設(shè)染料儲備溶液為 10 mM）在有效搖動下倒入蛋白質(zhì)溶液（95 µL 溶液 A）小瓶中。 假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為 10 mg/mL 且蛋白質(zhì)的分子量為 ~200KD，則蛋白質(zhì)的濃度為 ~0.05 mM。
注意：我們建議使用 10:1 摩爾比的溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白質(zhì)）。 如果太低或太高，分別確定染料/蛋白質(zhì)比例為 5:1、15:1 和 20:1。
1.2在室溫下繼續(xù)旋轉(zhuǎn)或搖動反應(yīng)混合物 30-60 分鐘。

2.純化綴合物
以下方案是使用 Sephadex G-25 柱進(jìn)行染料-蛋白質(zhì)綴合物純化的示例。
根據(jù)制造說明準(zhǔn)備 Sephadex G-25 柱。
2.1將反應(yīng)混合物（來自“1.進(jìn)行綴合反應(yīng)"）加載到 Sephadex G-25 列的頂部。
2.2樣品剛好在頂部樹脂表面下方運(yùn)行時(shí)，立即添加 PBS (pH 7.2-7.4)。
2.3向所需樣品中添加更多 PBS (pH 7.2-7.4) 以完成柱純化。 結(jié)合含有所需染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的組分。
注意：要立即使用，染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物需要用染色緩沖液稀釋，并分裝多次使用。
注意：對于長期儲存，染料-蛋白質(zhì)綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥。

3.數(shù)據(jù)處理

3.1表征所需的染料-蛋白質(zhì)綴合物
取代度 (DOS) 是表征染料標(biāo)記蛋白質(zhì)的重要因素。 較低 DOS 的蛋白質(zhì)通常具有較弱的熒光強(qiáng)度，但較高 DOS 的蛋白質(zhì)（例如 DOS > 6）也往往具有較低的熒光強(qiáng)度。 大多數(shù)抗體的 DOS 建議在 2 到 10 之間，具體取決于染料和蛋白質(zhì)的特性。 為了有效標(biāo)記，應(yīng)控制取代度，使 6-8 摩爾 iFluor Ultra 647 SE 對 1 摩爾抗體。 以下步驟用于確定 iFluor Ultra 647 SE 標(biāo)記蛋白質(zhì)的 DOS。

3.2吸收檢測
要檢測染料-蛋白質(zhì)綴合物的吸收光譜，建議將樣品濃度保持在 1-10 µM 的范圍內(nèi)，具體取決于染料的消光系數(shù)。

3.3讀取 280 nm 處的 OD（吸光度）和染料大吸光度（對于 iFluor Ultra 647 染料，?max = 588 nm）
對于大多數(shù)分光光度計(jì)，樣品（來自色譜柱餾分）需要用去離子水稀釋，以便 OD 值在 0.1 到 0.9 的范圍內(nèi)。 OD（吸光度）在 280 nm 是蛋白質(zhì)的大吸收，而 588 nm 是 iFluor Ultra 647 SE 的大吸收。 要獲得準(zhǔn)確的 DOS，請確保綴合物中不含非結(jié)合染料。

3.4計(jì)算DOS
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