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Annexin V-EGFP-碧云天細(xì)胞凋亡檢測試劑盒

產(chǎn)品編號	產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品包裝
C1067S	Annexin V-EGFP細(xì)胞凋亡檢測試劑盒	20次
C1067M	Annexin V-EGFP細(xì)胞凋亡檢測試劑盒	50次

Annexin V-EGFP -碧云天細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-EGFP Apoptosis Detection Kit)是用EGFP標(biāo)記的重組人Annexin V來檢測細(xì)胞凋亡時出現(xiàn)在細(xì)胞膜表面的磷酯酰的一種細(xì)胞凋亡檢測試劑盒。可以使用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測設(shè)備進(jìn)行檢測。
Annexin是一類廣泛分布于真核細(xì)胞細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子依賴的磷酯結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。但僅Annexin V被報道可以調(diào)控一些PKC的活性。
Annexin V選擇性結(jié)合磷酯酰(phosphatidylserine，簡稱PS)。磷酯酰主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，即與細(xì)胞漿相鄰的一側(cè)。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細(xì)胞都會把磷酯酰外翻到細(xì)胞表面，即細(xì)胞膜外側(cè)。磷酯酰暴露到細(xì)胞表面后會促進(jìn)凝血和炎癥反應(yīng)。而Annexin V和外翻到細(xì)胞表面的磷酯酰結(jié)合后可以阻斷磷酯酰的促凝血和促炎癥反應(yīng)活性。
用帶有綠色熒光的熒光探針EGFP標(biāo)記的Annexin V，即Annexin V-EGFP，就可以用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡非常簡單而直接地檢測到磷酯酰的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。
本試劑盒還提供了碘化丙啶染色液，碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)可以染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞，呈現(xiàn)紅色熒光。對于壞死細(xì)胞，由于細(xì)胞膜的完整性已經(jīng)喪失，Annexin V-EGFP可以進(jìn)入到細(xì)胞漿內(nèi)，與位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷酯酰結(jié)合，從而也使壞死細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。
綜上所述，用Annexin V-EGFP和碘化丙啶染色后，正常的活細(xì)胞不被Annexin V-EGFP和碘化丙啶染色；凋亡早期的細(xì)胞僅被Annexin V-EGFP染色，碘化丙啶染色呈陰性；壞死細(xì)胞和凋亡晚期的細(xì)胞可以同時被Annexin V-EGFP和碘化丙啶染色。
一個包裝的本試劑盒共可以檢測20個樣品。

包裝清單：

產(chǎn)品編號	產(chǎn)品名稱	包裝
C1067S-1	Annexin V-EGFP	100μl
C1067S-2	Annexin V-EGFP結(jié)合液	12ml
C1067S-3	碘化丙啶染色液	220μl
—	說明書	1份

Annexin V-EGFP-碧云天細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的保存條件：

4℃保存，半年有效。-20℃保存，一年有效。AnnexinV-EGFP和碘化丙啶染色液需要避光保存。為了長期保存，可以把碘化丙啶染色液適當(dāng)分裝后-20℃保存。

注意事項(xiàng)：
盡管經(jīng)測試Annexin V-EGFP反復(fù)凍融5次對于其檢測效果無顯著影響，但為取得良好的使用效果，3-6個月內(nèi)推薦4℃保存，并適當(dāng)注意避免反復(fù)凍融。
如果有細(xì)菌或真菌污染，會嚴(yán)重影響檢測效果。
染色后宜盡快檢測，時間過長可能會導(dǎo)致凋亡或壞死細(xì)胞的數(shù)量增加。
如果細(xì)胞收集過程中使用了，需注意設(shè)法去除殘留的。殘留的會消化并降解Annexin V-EGFP，最終導(dǎo)致染色失敗。
熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，在進(jìn)行熒光觀察時，盡量縮短觀察時間，同時在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。
需自備PBS。

Annexin V-EGFP -碧云天細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 使用說明：
1.對于懸浮細(xì)胞：
A.在進(jìn)行完細(xì)胞凋亡刺激后，1000g(約1000-2000rpm)離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。注意：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過程同時也起到了洗滌細(xì)胞的作用，可以保證后續(xù)Annexin V-EGFP的結(jié)合。
B.取5-10萬重懸的細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入195μl Annexin V-EGFP結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。
C.加入5μl Annexin V-EGFP，輕輕混勻。
D.加入10μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
E.室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中。可以使用鋁箔進(jìn)行避光。孵育過程中可以重懸細(xì)胞2-3次以改善染色效果。
F.隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，Annexin V-EGFP為綠色熒光，碘化丙啶(PI)為紅色熒光。如果用于熒光顯微鏡檢測，1000g離心5分鐘，收集細(xì)胞，用50-100μl Annexin V-EGFP結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。
2.對于貼壁細(xì)胞：
A.把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次，加入適量細(xì)胞消化液(可含有EDTA)消化細(xì)胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來時，吸除細(xì)胞消化液。需避免的過度消化。
B.加入步驟2A中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。注意：加入步驟2A中的細(xì)胞培養(yǎng)液一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞，另一方面細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清可以有效抑制或中和殘留的；殘留的會消化并降解后續(xù)加入的Annexin V-EGFP導(dǎo)致染色失敗。
C.取5-10萬重懸的細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入195μl Annexin V-EGFP結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。
D.加入5μl Annexin V-EGFP，輕輕混勻。
E.加入10μl 碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
F.室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中?？梢允褂娩X箔進(jìn)行避光。孵育過程中可以重懸細(xì)胞2-3次以改善染色效果。
G.隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，Annexin V-EGFP為綠色熒光，碘化丙啶(PI)為紅色熒光。如果用于熒光顯微鏡檢測，1000g離心5分鐘，收集細(xì)胞，用50-100μl Annexin V-EGFP結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。
3.對于貼壁細(xì)胞的原位熒光顯微鏡檢測：
注：本方法的優(yōu)點(diǎn)是可以原位觀察細(xì)胞凋亡，缺點(diǎn)是部分凋亡由于不貼壁而檢測不到。
A.(選做) 如果條件許可，把細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板、48孔板或96孔板內(nèi)。在凋亡誘導(dǎo)結(jié)束后，用可以對多孔板進(jìn)行離心的離心機(jī)1000g離心5分鐘。
B.吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入PBS洗滌一次。(如果條件許可，在吸除PBS00g離心5分鐘。)
C.加入195μl Annexin V-EGFP結(jié)合液。
D.加入5μl Annexin V-EGFP，輕輕混勻。
E.加入10μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
F.室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中。可以使用鋁箔進(jìn)行避光。孵育過程中可以重懸細(xì)胞2-3次以改善染色效果。
G.隨即在熒光顯微鏡下觀察，Annexin V-EGFP為綠色熒光，碘化丙啶(PI)為紅色熒光。