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高分辨率納米單顆粒分析儀 Nanocoulter Ⅰ

一種全“芯"的細(xì)胞外囊泡檢測(cè)手段

細(xì)胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是指從細(xì)胞膜上脫落或者由細(xì)胞分泌的雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡狀小體，直徑從40nm到1000nm不等。

胞外囊泡主要由微囊泡（Microvesicles, MVs）和外泌體（Exosomes, Exs）組成，微囊泡是細(xì)胞激活、損傷或凋亡后從細(xì)胞膜脫落的小囊泡，直徑約為100nm – 1000nm。外泌體（exosome）是一種由細(xì)胞釋放到細(xì)胞外基質(zhì)的膜性小囊泡，直徑約為40-100nm（有說30-150nm，目前尚無定論），廣泛存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清以及各種體液（血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁）中，攜帶有細(xì)胞來源相關(guān)的多種蛋白質(zhì)、脂類、DNA、mRNA、miRNA等，參與細(xì)胞間通訊、細(xì)胞遷移、血管新生和免疫調(diào)節(jié)等過程。在糖尿病、心血管疾病、艾滋病、慢性炎癥疾病以及癌癥中都發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外囊泡水平的升高，它們很有可能成為這類疾病的診斷標(biāo)志物。

相比外泌體研究遍地開花的火熱程度（僅國(guó)內(nèi)6月份就有217篇相關(guān)論文），外泌體純化和提取方法可謂是差強(qiáng)人意。目前主流的方法有超速離心（UC）、密度梯度離心（DGC）、免疫捕獲、聚合物沉淀（Precip）、超濾（UF）、排阻色譜（SEC），以及微流控分析芯片等。往往一種提取方法無法得到足夠純度、濃度的外泌體，每種方法的適用樣品種類也不一樣。

細(xì)胞外泌體

圖1 細(xì)胞外囊泡的形成過程

國(guó)際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì)（ISEV）在2014年提議，對(duì)于分離獲得的外泌體需要從三個(gè)層面進(jìn)行鑒定：

（1）Western Blot（WB）鑒定外泌體表面標(biāo)志物；

（2）透射電鏡（TEM）鑒定外泌體形態(tài)；

（3）粒徑分析鑒定外泌體大小。免疫印跡與電鏡觀察耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜、價(jià)格昂貴，在實(shí)際研究中難以做到每個(gè)外泌體樣本都去做WB與TEM，所以急需一種快速簡(jiǎn)便的粒徑分析方法，來作為外泌體鑒定的 “先鋒" 。

Nanocoulter Ⅰ “芯"方式助力外泌體提取純化研究

粒度儀

圖2 Nanocoulter Ⅰ外觀

Nanocoulter Ⅰ 單顆粒檢測(cè)，可液體活檢、一個(gè)樣本測(cè)試僅需5-10分鐘，測(cè)試樣本可回收等特性，恰好貼合該需求，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞外囊泡（外泌體）的提取鑒定工作中。

電脈沖

圖3 Nanocoulter Ⅰ原理圖

Nanocoulter Ⅰ原理

圖4 Nanocoulter Ⅰ核心技術(shù)

納米庫(kù)爾特原理，測(cè)試過程是將待測(cè)外泌體分散在電解液中，隨其通過特定孔徑的納米孔芯片，外泌體通過納米孔的一瞬間會(huì)占用相同體積電解液的位置，在孔內(nèi)外兩電極間的電阻（恒電流設(shè)計(jì)的電路）會(huì)發(fā)生瞬時(shí)變化，產(chǎn)生電位脈沖。脈沖信號(hào)的強(qiáng)度和次數(shù)與通過納米孔的外泌體顆粒大小及數(shù)目成一定比例，直接將脈沖信號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)換，即可獲得檢測(cè)樣品中外泌體的粒徑和粒子數(shù)信息。

Nanocoulter Ⅰ采用新一代電學(xué)原理，

?單顆粒檢測(cè)，顆粒粒徑、濃度、zeta電位、形態(tài)多維度檢測(cè)

?不受樣本吸光度、折射率影響，與樣本光學(xué)性質(zhì)無關(guān)

?與顆粒布朗運(yùn)動(dòng)無關(guān)，不受樣品黏度影響

?顆粒之間無干擾，對(duì)多分散樣本有很好的測(cè)試效果

?高分辨率，可精確看到樣本團(tuán)聚、破裂、沉降等細(xì)微變化

選型表

Nanocoulter Ⅰ 性能參數(shù)：

檢測(cè)的粒度范圍：40nm-2μm

尺寸測(cè)定精度：1nm

濃度范圍：1E+06~1E+12個(gè)/mL

樣本量：50μL

重復(fù)性誤差：＜10%

粒徑準(zhǔn)確性誤差：＜10%

濃度準(zhǔn)確性誤差：＜20%

隨著研究的深入，更多的分離提取外泌體的方法被開發(fā)出來，也有多種提取方法聯(lián)用的方式，看似百花齊放，實(shí)則良莠不齊，甚至都不盡如人意。Nanocoulter Ⅰ 逐個(gè)測(cè)量外泌體粒徑，得到外泌體的真實(shí)粒徑濃度分布，可快速判斷提取方法的優(yōu)劣。

粒度分析儀

圖5 不同分離提取方法的外泌體粒徑測(cè)定

Nanocoulter Ⅰ單顆粒檢測(cè)，得到所有顆粒的真實(shí)分布狀況，快、準(zhǔn)、狠地判別提取方法的優(yōu)劣性，大大節(jié)省了時(shí)間和人力成本。

Nanocoulter Ⅰ “快"

測(cè)量核心元器件芯片，采用激光刻蝕，納米孔一致性非常高，并且所有對(duì)標(biāo)信息均已裝入檢測(cè)卡中的二維碼中，因此儀器無需再次校準(zhǔn)、對(duì)標(biāo)等繁瑣測(cè)試前步驟，節(jié)省了大量寶貴的時(shí)間。一卡一碼，掃描二維碼，加入樣本，即可開始測(cè)試。并且樣本只存在于插入式檢測(cè)卡樣品槽中，檢測(cè)過程中不影響外泌體活性，寶貴的外泌體樣本測(cè)試完成后可回收做后續(xù)研究。

Nanocoulter Ⅰ“準(zhǔn)"

Nanocoulter Ⅰ的原理決定測(cè)得的數(shù)據(jù)為真實(shí)粒徑信息，無需經(jīng)過反演算或者推導(dǎo)得出，并且配備多種尺寸的已知粒徑和濃度的標(biāo)準(zhǔn)顆粒（60-300nm，20nm一個(gè)梯度）來作為基線數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)測(cè)量數(shù)據(jù)的定量校準(zhǔn)，確保粒徑、濃度數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確。無論是不同粒徑的混合樣本，還是有細(xì)微差異的同粒徑樣本，均能準(zhǔn)確無誤的辨別出來。

粒度儀

圖6 不同廠家生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)微球的細(xì)微差異

Nanocoulter Ⅰ“狠"

Nanocoulter Ⅰ在經(jīng)典庫(kù)爾特原理的基礎(chǔ)上，深耕微納加工技術(shù)十余年，具有原子級(jí)別（1納米以下）精度微加工能力，分辨率可達(dá)1nm。納米孔每通過一個(gè)顆粒就產(chǎn)生一個(gè)電位脈沖，因此樣本中所有外泌體顆粒均能準(zhǔn)確測(cè)量，實(shí)現(xiàn)真正意義上的的單顆粒檢測(cè)。測(cè)試過程可直觀的看到外泌體樣本中外泌體顆粒的真實(shí)分布情況，測(cè)試完成即可立即輸出報(bào)告。

實(shí)驗(yàn)室儀器