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YIJI 細胞 NADPH 氧化酶活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

YIJI 細胞 NADPH 氧化酶活性比色法定量檢測試劑是一種旨在使用特異性抑制劑，通過反應系統(tǒng)測定

樣品中還原型*腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化后峰值的降低，即采用比色法測定樣品中酶活性

的而經典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種細胞樣品（動

物或人體）還原型*腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH 氧化酶）的特異活性檢測。用于免疫、血

液研究、蛋白組學、病理生理學等研究。產品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能

穩(wěn)定，反應優(yōu)化，檢測敏感。

技術背景

NADPH氧化酶，通常稱為還原型*腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（reduced nicotinamide adenine

dinucleotide phosphate oxidase；NADPH oxidase；EC1.6.3.1）或還原型輔酶II氧化酶，是機體防御機制中的

重要元素。NADPH氧化酶由6個亞體構成：Rho GTP酶（Rho guanosine triphosphatase）和5個phox（吞噬細

胞氧化酶；phagocytic oxidase） 其中主要包含細胞膜嵌合蛋白質分子。（gp91phox、p22phox、flavocytochrome

b558等），以及位在細胞質內的蛋白質分子（p47phox、p67phox、p40phox、Rac1、Rac2等）。其zui特征性的

酶活性是超氧化物歧化酶敏感的還原型*腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶。細胞膜上的NADPH氧化酶被激

活，將還原型輔酶Ⅱ（NADPH）轉變?yōu)檠趸洼o酶Ⅱ（NADP），氧分子則獲得電子形成超氧陰離子O2-，

由O2-又可生成H2O2和OH－。其超氧陰離子產物具有殺死微生物的功能。NADPH氧化酶異常將導致慢性肉

芽腫病（Chronic Granulomatous Disease；CGD）?；诘孜镞€原型*腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），

在特異性抑制劑聯(lián)苯基三價碘（diphenyleneiodonium；DPI）的存在下，受到NADPH氧化酶的催化作用，

轉化為氧化型*腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP），產生吸光峰值的變化，通過分光光度儀（340nm波長）

檢測，來測定NADPH氧化酶的特異活性。其反應方式為：

產品內容

YIJI 清理液（Reagent A）

YIJI 裂解液（Reagent B）

YIJI 緩沖液（Reagent C）

YIJI 反應液（Reagent D）

YIJI 陰性液（Reagent E）

YIJI 底物液（Reagent F）

YIJI 專性液（Reagent G）

產品說明書

毫升

毫升

毫升

毫升

毫升

微升

微升

1份

保存方式

1

保存 YIJI 清理液（Reagent A） YIJI 陰性液和（Reagent E） 4℃冰箱里，在其余的保存在在－20℃

冰箱里，避免反復凍融；YIJI 反應液（Reagent D）和 YIJI 底物液（Reagent F），避免光照，有

效保證 6 月

用戶自備

15 毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5 毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離

4℃（微型）臺式離心機：用于樣品處理

恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水槽：用于反應物孵育

比色皿：用于比色測定的容器

分光光度儀：用于比色分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；YIJI 反應液（Reagent D）和

YIJI 底物液（Reagent F）注意避光。然后進行下列操作。

一、樣品準備

準備好 25cm2細胞培養(yǎng)瓶或 60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1 至 5 X 106細胞）

小心加入 xx 毫升 YIJI 清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

小心抽去清理液

使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用*消化）

加入 xx 毫升 YIJI 清理液（Reagent A），混勻細胞

移入到預冷的 15 毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）

放進 4℃臺式離心機離心 5 分鐘，速度為 300g

小心抽去上清液

加入 xx 微升 YIJI 裂解液（Reagent B），充分混勻

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10. 轉移到預冷的 1.5 毫升離心管

11. 強力渦旋震蕩 15 秒

12. 置于冰槽里孵育 30 分鐘

13. 放進 4℃微型臺式離心機離心 5 分鐘，速度為 16000g（或 13000RPM，例如 eppendorf 5415）

14. 小心移取 500 微升上清液到新的預冷的 1.5 毫升離心管

15. 移取 10 微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 YIJI Bradford 蛋白質濃度定量試劑盒－

GMS30030.1）

16. 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、測定準備

1． 從-70℃取出待測樣品（例如細胞裂解懸液樣品等），置于冰槽里

2． 設定好分光光度儀（溫度為 30℃）：波長為 340nm，間隔 60 秒，讀數(shù) 6 次（共 5 分鐘），并置零

2

三、 背景對照測定

1． 移取 xx 微升 YIJI 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升 YIJI 反應液（Reagent D）

3． 加入 xx 微升 YIJI 底物液（Reagent F）

4． 放進 30℃培養(yǎng)箱里靜置 3 分鐘

5． 加入 xx 微升 YIJI 陰性液（Reagent E）

6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內）

7． 即刻放入分光光度儀檢測，此為背景空對照：（340 波長讀數(shù)）0 分鐘－（340 讀數(shù)）5 分鐘

四、 樣品總活性測定

移取 xx 微升 YIJI 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

加入 xx 微升 YIJI 反應液（Reagent D）

加入 xx 微升 YIJI 底物液（Reagent F）

放進 30℃培養(yǎng)箱里靜置 3 分鐘

加入 100 微升待測樣品（注意：50 至 100 微克細胞裂解懸液蛋白；樣品須溶解；參見注意事項 5、11

1.

2.

3.

4.

5.

和 12）

6.

7.

上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內）

即刻放入分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：（340 波長讀數(shù)）0 分鐘－（340 讀數(shù)）5 分鐘

五、 樣品非特異活性測定

1． 移取 xx 微升 YIJI 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升 YIJI 反應液（Reagent D）

3． 加入 xx 微升 YIJI 專性液（Reagent G）

4． 加入 100 微升待測樣品（注意：50 至 100 微克細胞裂解懸液蛋白；樣品須溶解；參見注意事項 5、11

和 12）

5． 放進 30℃培養(yǎng)箱里靜置 3 分鐘

6． 加入 xx 微升 YIJI 底物液（Reagent F）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內）

8． 即刻放入分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數(shù)：（340 波長讀數(shù)）0 分鐘－（340 讀數(shù)）5 分鐘

六、 計算樣品活性

1）樣品總活性

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.1（樣品容量，毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 5（分鐘）]

＝單位/毫升或微摩爾 NADPH/分鐘/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克＝單位/毫克或微摩爾

NADPH/分鐘/毫克

或者

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.1（樣品重量，毫克）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 5（分鐘）]

＝單位/毫克＝微摩爾 NADPH/分鐘/毫克

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