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3.膜分離技術(shù)

在蛋白質(zhì)純化過(guò)程中主要用到的膜分離技術(shù)多為超濾。在靜壓作用下降溶液通過(guò)孔徑非常小的濾膜，使溶液中分子量較小的溶質(zhì)透過(guò)薄膜，而大分子被截留于膜表面。大多數(shù)超濾膜是由一層非常薄的功能膜與較厚的支撐膜結(jié)合在一起而組成的。功能膜決定了膜的孔徑，而支撐膜提供機(jī)械強(qiáng)度以抵抗靜壓力。超濾濃縮的優(yōu)點(diǎn)是：操作條件溫和，無(wú)相變化，對(duì)生物活性物質(zhì)沒(méi)有破壞。

超濾系統(tǒng)主要由料液貯罐、泵、超濾器、透過(guò)液收集罐組成，料液經(jīng)泵打入超濾器，水及低分子量物質(zhì)排出超濾器外，被濃縮的料液在料液貯罐、泵、及超濾器中循環(huán)。當(dāng)料液濃縮至一定的倍數(shù)后即可作為進(jìn)一步處理的濃縮料液。

超濾應(yīng)用于蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)的濃縮和脫鹽過(guò)程中時(shí)應(yīng)注意以下問(wèn)題：*，在超濾循環(huán)過(guò)程中，由于泵和葉輪與料液的摩擦放熱作用，料液的溫度會(huì)逐漸升高，會(huì)造成蛋白質(zhì)分子的損失。因此，料液貯罐應(yīng)加冷卻系統(tǒng)，并安裝自動(dòng)測(cè)溫及控制系統(tǒng)。第二，某些酶的輔助因子散失為問(wèn)題：一些酶含有輔助因子，其分子量小，超濾時(shí)易從透過(guò)液中排除掉，因而在超濾前或超濾后要添加一定濃度的的輔助因子。

還可將超濾與親和層析相結(jié)合以提高分離純度。其工作原理是：當(dāng)溶液中欲被分離的蛋白質(zhì)不受阻礙地通過(guò)超濾膜的孔隙時(shí)，如果在膜的一側(cè)結(jié)合著親和配基，該蛋白質(zhì)就會(huì)與配基結(jié)合因而結(jié)聚在膜的這一側(cè)。不與配基結(jié)合的其他物質(zhì)就將穿過(guò)孔而被帶走。再用適宜的洗脫劑將該蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)，洗脫液用于進(jìn)一步的分離純化。

4.泡沫分離

原理：將氣體通入含多種組分的溶液中，由于這些組分的表面活性由差異，因此在溶液的表面，某些組分將形成泡沫，泡沫的穩(wěn)定性取決于操作條件及溶液的生物學(xué)特性。泡沫中含有更多的表面活性成分，故泡沫的組分種類(lèi)及其含量與溶液中的不相同。這樣，溶液中的組分舅得以分離。

蛋白質(zhì)較易吸附與氣液界面，這有利于其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。泡沫分離過(guò)程是：蛋白質(zhì)從主體溶液中擴(kuò)散到氣液界面，該過(guò)程可能是可逆的也可能是不可逆的；分子發(fā)生重排，一般認(rèn)為在空氣-水界面會(huì)形成兩種類(lèi)型的膜，一種是稀膜，另一種是濃膜，可能會(huì)發(fā)生由多個(gè)分子聚集在一起的現(xiàn)象。在氣液界面形成的蛋白質(zhì)膜可以是單層的也可以是多層的。膜的類(lèi)型取決于主體溶液及氣液界面上蛋白質(zhì)的特性、結(jié)構(gòu)和濃度。

泡沫分離的目的，一方面提高酶蛋白的富集率（泡沫中蛋白質(zhì)的濃度/zui初溶液中蛋白質(zhì)濃度），另一方面提高酶蛋白的提取率（泡沫中蛋白質(zhì)的提取率/zui初的蛋白質(zhì)質(zhì)量），或使多組分混合物中某一組分的分配系數(shù)zui大。

二、抽提 沉淀

1.        鹽析

常用的鹽析劑是硫酸銨，其溶解度大、價(jià)格便宜。硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)的能力很強(qiáng)，其飽和溶液能使大多數(shù)的蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)。對(duì)酶沒(méi)有破壞作用。

pH的控制：應(yīng)從酶的溶解度與穩(wěn)定性兩個(gè)方面考慮，在酶等電點(diǎn)時(shí)其溶解度zui小易沉淀，但有些酶再等電點(diǎn)時(shí)穩(wěn)定性較差，因此要選擇*pH值.一般要求在酶zui穩(wěn)定的pH值的前提下再考慮zui適宜酶沉淀的pH值。在操作中一旦確定*pH值后，在添加硫酸銨之前甲酸或堿調(diào)節(jié)好酶液的pH值，要盡量避免溶液pH值的波動(dòng)以免破壞酶的穩(wěn)定性。在添加硫酸銨時(shí)要注意攪拌，并注意硫酸銨的加入速度，一般是由少到多，緩慢加入，硫酸銨盡可能磨成細(xì)粉。

溫度的控制：有些酶在較高溫度下穩(wěn)定性能較好，可在常溫下進(jìn)行鹽析操作，而對(duì)于大多數(shù)酶，盡可能在低溫下操作。

酶液的凈置：加完硫酸銨后，酶液要靜置一段時(shí)間，使酶蛋白*沉淀下來(lái)，酶靜置后，就不要再加以攪拌。

2．有機(jī)溶劑沉淀

有機(jī)溶劑選擇：可用于酶蛋白沉淀的有機(jī)溶劑包括醇類(lèi)物質(zhì)等，如甲醇、乙醇、異丙醇。乙醇的親水性能較好，可防止蛋白質(zhì)的變性，酶蛋白在其中的溶解度也較低。

有機(jī)溶劑沉淀操作：有機(jī)溶劑一般都使蛋白質(zhì)變性，當(dāng)溫度較高時(shí)變性蛋白質(zhì)分子就會(huì)變成*失活。因此用有機(jī)溶劑處理時(shí)在0℃以下進(jìn)行。用有機(jī)溶劑沉淀得到的酶蛋白不要放置過(guò)久，要盡快加水溶解。

3.聚合物絮凝劑沉淀     聚合物絮凝劑，如葡聚糖和聚乙二醇，與酶分子爭(zhēng)奪水分子，具有脫水作用使酶沉淀。聚乙二醇作為一種沉淀劑的優(yōu)點(diǎn)是在水溶液中，其濃度可達(dá)到50%，濃度為6%-12%的蛋白質(zhì)大都可以沉淀下來(lái)。這種試劑不需要低溫操作，而且對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定還有一定的保護(hù)作用。聚乙二醇不會(huì)被吸附，故在離子交換吸附前不必去除。

4．用金屬離子和絡(luò)合物沉淀

酶和其他蛋白質(zhì)都會(huì)形成金屬鹽，其溶解度較低。用金屬離子沉淀的缺點(diǎn)是酶與金屬離子相互作用后，可逆變化較差，尤其是用巰基衍生物，它結(jié)合的]金屬離子會(huì)催化酶變性而失活。

5．用特殊試劑沉淀法

用*可選擇性去除核酸，從而使胞內(nèi)酶沉淀出來(lái)。*鹽（濃度為0.5-1.0mg/mg蛋白質(zhì)）對(duì)于選擇性沉淀核酸的效果比錳離子還要好，酶不易失活。