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流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry,FCM）質(zhì)量控制
點擊次數(shù)：145 發(fā)布時間：2013-4-23
流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry,FCM）越來越廣泛的應(yīng)用在臨床檢驗中。由于臨床檢驗本身的性質(zhì)，它要求臨床檢驗的管理者和操作人員必須把好常規(guī)操作已經(jīng)結(jié)果分析的質(zhì)量關(guān)。同時還必須懂得如何判斷分是在控還是失控。作為臨床檢驗工作，其工作的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)就是使檢驗的結(jié)果*地符合病人有無病變的實際情況。在臨床檢驗中分為分析前、分析中、分析后的質(zhì)量控制。分析前的質(zhì)量控制主要內(nèi)容是標(biāo)本采集、保存和傳送等；分析中的質(zhì)量控制即實驗操作過程的控制；分析后的質(zhì)量控制主要是對數(shù)據(jù)結(jié)果的處理，對檢驗結(jié)果的可信度評價和及時將報告送給臨床并聽取反饋意見。為此，從臨床醫(yī)師開出化驗單，，直至拿到檢驗報告的整個過程都在質(zhì)量控制的范疇之中，即所謂全程質(zhì)量控制。它包括質(zhì)量保證、質(zhì)量控制和質(zhì)量評估。質(zhì)量保證，指圍繞所有的步驟，監(jiān)測和評估實驗室規(guī)章制度與操作流程的效力。主要利用質(zhì)量控制和質(zhì)量評估。質(zhì)量控制指建立一套完善的實驗室監(jiān)控方法，保證結(jié)果的可靠性，提高準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性和室間結(jié)果的可比性。對于一個實驗，應(yīng)建立一套包括各種可變因素（儀器設(shè)備、樣本處理、試劑、操作過程、數(shù)據(jù)分析等）的操作規(guī)程。質(zhì)量評估是由一個區(qū)域性的、國家的或性的機(jī)構(gòu)，組織通過一系列的方法來比較實驗室內(nèi)或不同實驗室之間的結(jié)果而建立的一套評價系統(tǒng)。其主要目的是建立室間和儀器設(shè)備之間的可比性。當(dāng)一個標(biāo)準(zhǔn)品或參考標(biāo)準(zhǔn)存在時，質(zhì)量評估通常被稱為熟練度測試。因此，嚴(yán)格的質(zhì)量控制是*的臨床檢驗分析技術(shù)真正發(fā)揮作用的保證。
FCM作為一項*的檢測技術(shù)，對質(zhì)量控制自然也不例外。目前，F(xiàn)CM應(yīng)用于臨床檢驗的項目主要集中在幾個方面：1，免疫表型分析，包括外周血淋巴細(xì)胞表型分析、白血病/淋巴瘤免疫分型、血小板膜糖蛋白分析、HLA-B27檢測、陣發(fā)性血紅蛋白尿（PNH）的檢測等等。2，細(xì)胞DNA、RNA檢測及細(xì)胞周期分析，包括DNA倍體檢測、細(xì)胞周期分析、網(wǎng)織紅細(xì)胞檢測、網(wǎng)織血小板檢測等等。3，定量分析，包括愛滋病劃分中外周血CD4的定量、OKT3治療監(jiān)測中CD3的定量、干細(xì)胞移植中的CD34的定量等等。FCM實驗的質(zhì)量控制自然也包括儀器設(shè)備、樣本處理、試劑、操作過程、數(shù)據(jù)分析等整個實驗過程的質(zhì)控。
一、流式細(xì)胞儀的校準(zhǔn)
流式細(xì)胞儀的校準(zhǔn)包括流路的穩(wěn)定性、光路的穩(wěn)定性、多色標(biāo)記熒光顏色補償、光電倍增管轉(zhuǎn)換的線性和穩(wěn)定性。對儀器的校準(zhǔn)主要是利用標(biāo)準(zhǔn)微球進(jìn)行監(jiān)測。聚苯乙烯可以被做成各種大小的微球，也可被熒光標(biāo)記或者擁有定量免疫球蛋白的結(jié)合位點。這種制成固定熒光強(qiáng)度、大小和光散射性的聚苯乙烯微球，已成為流式質(zhì)控中的一個常用的標(biāo)準(zhǔn)品。BECKMAN COULTER公司擁有儀器校準(zhǔn)所需全部標(biāo)準(zhǔn)微球（見表一）。另外，在顏色補償方面，BECKMAN COULTER公司的流式細(xì)胞儀除了可以用標(biāo)準(zhǔn)補償試劑來完成外，還可以直接利用生物樣品進(jìn)行自動顏色補償，這使多色標(biāo)記變得非常容易。BECKMAN COULTER公司的流式細(xì)胞儀所帶的全程質(zhì)控軟件，使日常儀器性能的質(zhì)控以及質(zhì)量控制評估都可自動完成。
二、實驗操作過程的質(zhì)控
（一）樣本的質(zhì)量控制
用于流式分析的樣本種類很多，包括外周血、骨髓穿刺液、骨髓活檢物、組織活檢物、漿膜腔積液、腦脊液、皮膚、黏膜（內(nèi)窺鏡活檢物）、細(xì)針穿刺物等等。樣本的條件控制可能是免疫表型分析質(zhì)控zui困難的環(huán)節(jié)之一。每種樣本都有不同的采集、保存、運輸和制備要求。首先，觀測樣本外觀：有嚴(yán)重溶血、凝聚或壞死的樣本應(yīng)棄用。第二，單細(xì)胞懸液的獲取：外周血和骨髓穿刺液為天然單細(xì)胞懸液；活檢組織常用機(jī)械分離和酶消化兩種方法。不同的實驗要求適用不同的方法。對于需要進(jìn)行膜抗原標(biāo)記的，不僅是要獲得足夠的單細(xì)胞懸液，還要盡量保證細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性和抗原性，機(jī)械法較適用。只需進(jìn)行細(xì)胞周期或DNA倍體分析的，在機(jī)械法的基礎(chǔ)上加酶消化（如*、*等）較適用。第三，抗凝劑的選擇：外周血標(biāo)本可采用EDTA、ACD或肝素抗凝。如果用同一份血標(biāo)本做白細(xì)胞計數(shù)和流式分析，則應(yīng)用EDTA抗凝；對于血小板分析的實驗，一般不用肝素抗凝。骨髓穿刺液常用肝素或EDTA抗凝。由于相對大量的ACD會通過改變pH而影響骨髓細(xì)胞活性問題，通常不推薦用ACD作骨髓穿刺液的抗凝劑。第四，樣本的保存：理想狀態(tài)下，樣本應(yīng)在采集后立刻進(jìn)行處理和染色。肝素抗凝的血和骨髓通?？杀４嬷?8-72小時/室溫（16-25）；EDTA抗凝的外周血和骨髓可保存12-24小時/室溫（16-25）；ACD抗凝的外周血可保存至72小時/室溫（16-25）；對于只作胞內(nèi)染色的樣本，可固定細(xì)胞以長期保存。但此“固定－染色”的方法取決于要分析的抗原特性和染色方式。第五，去除紅細(xì)胞的方法：紅細(xì)胞裂解法，操作簡單、快、并zui可能保持原始標(biāo)本的白細(xì)胞分布。在染色后溶血。若在染色前溶血，需確認(rèn)：1）抗原性不被溶血過程改變；2）溶血劑被*洗去，細(xì)胞和抗體結(jié)合的動力反應(yīng)未受影響；3）所用溶血劑不含固定劑，否則會影響細(xì)胞活性及表面標(biāo)記結(jié)果。密度梯度離心法，靶細(xì)胞回收較好并可能得到富集，同時去除紅細(xì)胞、碎片等，但費時，某些重要細(xì)胞群體可能被選擇性丟失。第六，細(xì)胞與抗體的比例：廠家推薦的抗體用量通常是假定靶細(xì)胞數(shù)量在5X105 ~1x106范圍內(nèi)。有些標(biāo)本沒有足夠的細(xì)胞，有些則由于細(xì)胞量大，正常濃度下的抗體相對過量或不足，導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果。因此，每個實驗室應(yīng)根據(jù)不同于廠家推薦的方法，調(diào)整細(xì)胞與抗體用量，得到zui適的細(xì)胞/抗體比例。第七，細(xì)胞活性的鑒定：死細(xì)胞對許多抗體均有很強(qiáng)的非特異性染色，這就使樣本細(xì)胞活性檢測變得非常重要，尤其是經(jīng)過了長時間運輸和儲存的樣本。檢測的方法通常有兩種：1）實時的流式檢測：利用熒光染料碘化吡啶（PI）、7氨基*（7-AAD）或EMA（ethidium monoacide）進(jìn)行死細(xì)胞染色，而活細(xì)胞拒染這些染料。此方法的優(yōu)勢是細(xì)胞表面標(biāo)志和活性分析可同時進(jìn)行。尤其適用于高度壞死的樣本。7-AADzui常用，因為在488nm激發(fā)下，其zui大發(fā)射光在670nm左右，適合與FITC 或PE進(jìn)行多色標(biāo)記。但隨著時間延長，7AAD會在固定的細(xì)胞群體重新分配，死活細(xì)胞的區(qū)分變得困難。因此，對于染色并在固定后12小時以上分析的標(biāo)本，用EMA。EMA與死細(xì)胞DNA穩(wěn)定的共價結(jié)合保證了長時間固定后仍能很好地區(qū)分固定前的死活狀態(tài)。2）手工檢測：使用Trypan blue 或其他細(xì)胞活性染料。3）使用專門的儀器進(jìn)行檢測。如Vi-cell.
（二）、選擇和確定單抗組合
流式分析zui基本的試劑就是抗體。所選抗體的好壞直接影響結(jié)果。影響抗體特性的因素很多，如F/P比值、亞型、全長或片段、種宿來源、標(biāo)記熒光種類等等。而且，有CD分類號的300多種單抗和大量沒有CD分類號的單抗使抗體的選擇更加困難。一般，選擇抗體組合遵循以下基本原則：1）所選的抗體組合應(yīng)足夠?qū)?，可以鑒別樣本中的所有細(xì)胞亞群包括正常和異常群體。2）對表達(dá)少的抗原應(yīng)盡可能選擇熒光強(qiáng)度強(qiáng)的熒光素標(biāo)記。3）了解不同抗體的細(xì)胞反應(yīng)譜，以及染色模式。根據(jù)不同的實驗?zāi)康倪x擇抗體。因為相同CD編號的抗體可能識別不同的抗原決定簇。4）抗體的多種組合可能相互影響與抗原的結(jié)合（如通過空間構(gòu)型的阻礙），所以對所用抗體組合，應(yīng)先了解每個抗體在對照細(xì)胞上單色標(biāo)記的表達(dá)情況。5）對于臨床實驗盡量選擇體外診斷（IVD）試劑和分析特異性（ASR）試劑，而僅供研究用（RUO）試劑一般不能用于體外診斷實驗。在我國，用于體外診斷的試劑還必須取得國內(nèi)的SDA認(rèn)證。這樣，一個抗體組合內(nèi)的抗體可能來源不同的公司，有不同的濃度、不同的亞型、不同F(xiàn)/P值，可能均需要自身的同型對照，而實際上，這是非常困難的。那么，盡量選擇同一家公司的試劑可以減少上述的干擾。對于臨床上常見的流式檢測項目，所需的試劑組合基本都有參考或推薦的抗體組合。